Study of the prodution of ligninolytic enzymes by Ceriporiopsis subvermispora

Este trabalho compreendeu estudar e definir as condições de cultivo que maximizam a produção de manganês peroxidases (MnPs) e lacases (Lacs) por C. subvermispora, fungo de degradação branca da madeira envolvido em processos industriais de biopolpação. O estudo envolveu cultivos submersos, em superfície ou com micélio imobilizado em espuma de poliuretano em meios complexo ou definido, e cultivos imobilizados em meio definido nos quais foram avaliados os efeitos: de diferentes concentrações de Mn2+, dos indutores 2,5-xilidina e álcool veratrílico, e do surfactante Tween 80, que levaram a diferentes níveis de expressões de Lacs e MnPs. Para a determinação de como essas condições afetam a produção das enzimas oxidativas (MnPs e Lacs), os cultivos foram avaliados cineticamente quanto à concentração de proteínas, às atividades enzimáticas, ao espectro de absorção de luz na região UV-VIS, ao teor de açúcares redutores, ao crescimento micelial, ao teor de amônio, ao pH, à condutividade elétrica. Também foram realizadas análises eletroforéticas de extratos de cultivos selecionados. Nos cultivos que tiveram como inóculo discos de micélio, a condição imobilizada em meio de composição complexa demonstrou potencial para produção de Lac (147,5 UI/L). Já nos cultivos inoculados com suspensão de micélio macerado em água, a condição imobilizada em meio de composição definida se destacou com produção seletiva de MnP (277,5 UI/L). Verificou-se que os cultivos em meio complexo nas formas submersa e imobilizada favoreceram a produção de Lac em detrimento de MnP. Nos cultivos de C. subvermispora imobilizado em espuma de poliuretano, em meio definido, a variação da concentração de manganês no meio de cultura alterou a produção de MnP, sendo a concentração de 11 ppm de Mn+2 promotora da máxima atividade (108,5 UI/L). No entanto, ao suprimir manganês do meio, ocorreu produção seletiva de Lac (15,5 UI/L). Com a suplementação do meio contendo 11 ppm de Mn+2 com 0,5 e 1,0 mM de 2,5-xilidina, foram alcançados máximos de atividade de Lac de 14,0 e 22 UI/L, respectivamente. A atividade máxima de MnP não foi afetada pela adição de 2,5-xilidina. Não houve aumentos significativos nas atividades máximas de Lac e de MnP quando o meio foi suplementado com álcool veratrílico. A suplementação do meio contendo 11 ppm de Mn+2 com Tween 80 nas concentrações de 0,05% e 0,5% v/v, em adição a 2,5-xilidina 1,0 mM, aumentou ainda mais a produção de Lac, com máximos de atividade de 53 e 61 UI/L, e de MnP, com picos de 175 e 182 UI/L, respectivamente. As eletroforeses em condições desnaturantes revelaram bandas proteicas de 12,4 a 118,3 KDa e nos géis de atividade foram detectadas atividades de MnP e Lac com mais de uma banda de atividade. Durante os cultivos, a exaustão de açúcares redutores acarretou em diminuição da concentração de micélio fúngico e aumento da concentração de nitrogênio amoniacal no meio, provavelmente devido à ocorrência de autólise celular. O pH e a condutividade variaram relativamente pouco. Em meio complexo, obsevou-se aumento da condutividade durante o cultivo, provavelmente devido à secreção de ácidos orgânicos pelo fungo.This work involved the research and definition of the culture conditions that maximize the production of manganese peroxidase (MnP) and laccase (Lac) by C. subvermispora, a white-rot fungus studied in biopulping industrial processes. The study involved submerged or static cultures with immobilized mycelium in polyuretane foam in complex or defined medium, and immobilized cultures in defined medium with different concentrations of Mn2+ and inductors, 2.5-xylidin and veratryl alcohol, and surfactant, Tween 80, resulting in different expressions levels of MnPs and Lacs. To determine how these conditions affect the production of oxidative enzymes (MnP and Lac), the cultures were evaluated kinetically regarding the concentration of proteins, enzymatic activities, the absorption of light in the UV-VIS regions, the concentration of reducing sugars, the micelyal growth, the concentration of ammonium, pH, electrical conductivity. We also performed electrophoretic analysis of some selected cultures. In the cultures inoculated whith discs of mycelium, the condition immobilized in poliuretane foam whith complex medium showed potential for producing Lac (147.5 IU / L). In the cultures inoculated with homogenized mycelium, the immobilized condition whith defined medium showed selective production of MnP (277.5 IU/L). It was found that the submerged and immobilized cultures in complex medium increased the production of Lac instead of MnP. In the immobilized cultures with defined medium, the variation of the concentration of manganese in the medium altered the production of MnP, being the concentration of 11 ppm that promoting maximum activity (108.5 IU/L). However, in the absence of manganese in the medium, the selective production of Lac (15.5 IU / L) was observed. With the supplementation of the defined medium containing 11 ppm Mn+2 with 0.5 or 1.0 mM 2.5-xylidine, maximum activities of Lac of 14.0 and 22.0 IU / L, respectively, were achieved. The maximum activity of MnP was not affected by the addition of 2.5-xylidine. There was no significant increase in the maximum activities of Lac and MnP when the medium was supplemented with veratryl alcohol. Supplementation of the medium with Tween 80, at concentrations of 0.05% and 0.5% v/v, in addition to 11 ppm Mn+2 and 1.0 mM 2.5-xylidine, further increased the production of Lac, with highest activities of 53 and 61 IU/L; MnP activities were 175 and 182 IU/L, respectively. Electrophoresis under denaturing conditions revealed bands of approximately 12.4-118.3 KDa in the electrophoresis non-denaturing PAGE showed MnP and Lac activities in differents bands. During the cultivations, the exhaustion of sugars led to decreased concentrations of mycelium and increased concentrations of ammonia in the extracts, probably due to the occurrence of cellular autolysis. The pH and conductivity showed low variations. The culture in complex medium showed an increased conductivitywith time, probably due to the secretion of organic acids by the fungus