Influence expression of integrin alpha-6 in the production of transgenic murine spermatogonial stem cells

Ao longo da vida reprodutiva dos machos adultos, espermatozoides são formados pelas células-tronco espermatogoniais (SSCs, do inglês spermatogonial stem cells) por um processo conhecido como espermatogênese. O cultivo in vitro de SSCs abriu novas possibilidades para a transgenia, no entanto os protocolos requerem a adição de fatores de crescimento, o que encarece a manutenção dessas células por um tempo prolongado, fazendo da criopreservação de SSCs uma alternativa para esse problema. O fenótipo molecular de células-tronco espermatogoniais tem sido objeto de estudo nas últimas décadas. Uma das moléculas mais estudadas como marcador na caracterização de espermatogônias é a alfa-6 integrina. Baseado nestas informações, a seguinte hipótese foi proposta: SSCs que apresentam maior expressão de alfa-6 integrina são mais eficientes para modificações genéticas e colonização de túbulos seminíferos. Para testar essa hipótese, as SSCs murinas foram dissociadas de testículos de camundongos com 8 a 11 dias de idade. Essas células foram cultivadas in vitro, caracterizadas quanto sua morfologia, congeladas e incubadas com anticorpo anti-alfa-6 integrina para a purificação das SSCs por separação celular ativada por fluorescência (FACS). Células testiculares foram geneticamente modificadas com a inserção do gene marcador LacZ e o transplante através dos ductos eferentes foi padronizado. As Células germinativas testiculares foram dissociadas e cultivadas in vitro, porém a viabilidade foi aquém da desejada, inviabilizando as etapas de transformação, transplante e posterior avaliação histológica. Usando o marcador molecular alfa-6 integrina foi possível separar populações de células germinativas testiculares por FACS e a expressão gênica de ITGα6, GFRα1, Oct-4 e Thy-1 foi detectada por RT-PCR quantitativo. Em conclusão, não foi possível comprovar a eficiência de transdução e colonização em túbulos seminíferos por células-tronco espermatogoniais selecionadas com alfa-6 integrina.Throughout the reproductive life of adult males, spermatozoa are formed from spermatogonial stem cells (SSCs) by a process known as spermatogenesis. The in vitro culture of SSCs created new possibilities for transgenesis, however the protocols require addition of growth factors, which increases the maintenance costs of these cells for a prolonged time, making of the cryopreservation of SSCs an alternative for this problem. The molecular phenotype of spermatogonial stem cells have been target of studies in recent decades. One of the most studied marker molecule in the characterization of spermatogonia is integrin alpha-6. Based on these informations, the following hypothesis was proposed: SSCs that show increased expression of integrin alpha-6 are more efficient for genetic modification and colonization of seminiferous tubules. In order to test this hypotesis, murine SSCs were dissociated from testes of 8 to 11 days old mice. These cells were in vitro cultured, characterized based on its morphology, frozen and incubated with anti-integrin alpha-6 antibody for the purification of SSCs by activated cell sorting fluorescence (FACS). Testicular cells were genetically modified with the insertion of the marker gene LacZ and transplantation through the efferent ducts was standardized. The testicular germ cells were dissociated and in vitro cultured, however viability was below expected, precluding the steps of transformation, transplantation and subsequent histological evaluation. Using molecular marker integrin alpha-6 it was possible to separate testicular germ cell populations by FACS and gene expression of ITGα6, GFRα1, Oct-4 and Thy-1was detected by quantitative RT-PCR. In conclusion, it was not possible to prove the efficiency of transduction and colonization in the seminiferous tubules by spermatogonial stem cells selected with alpha 6 integrin