Development of analytical methods to attend the green chemistry principles in the analysis of veterinary medicines in bovine milk

A utilização de medicamentos veterinários é de grande importância na produção animal, porém também pode trazer conseqüências negativas, como a presença de resíduos em alimentos, como o leite bovino. As sulfonamidas são uma classe de antibióticos utilizados no tratamento veterinário e humano, sendo de grande importância sua análise em alimentos de origem animal, como o leite, uma vez que podem provocar resistência bacteriana, reações alérgicas e intoxicações, comprometendo a segurança alimentar da população e prejudicando a fabricação de derivados lácteos. A maioria dos estudos vem utilizando a extração em fase sólida (SPE), na extração das sulfonamidas e no clean up da amostra. Entretanto, o método QuEChERS, introduzido em 2003, vem sendo considerado promissor na extração de diversos compostos em matrizes alimentícias. Assim, a presente pesquisa teve o objetivo de desenvolver e validar métodos analíticos, comparando os métodos de extração SPE e QuEChERS, com posterior análise por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de arranjo de diodos, para a determinação de sulfonamidas (sulfatiazol, sulfametazina e sulfadimetoxina) em leite bovino. Na otimização das condições cromatográficas e do método de extração QuEChERS, utilizou-se planejamentos experimentais. Primeiramente, foram otimizadas as condições cromatográficas, selecionando-se coluna C18 Luna (100 x 4,6 mm, 5 µm), 17 µL de volume de injeção, comprimento de onda de 290 nm, vazão de 0,50 mL min-1, temperatura de 20 °C e eluição gradiente com os solventes água e etanol. No método de extração QuEChERS, o procedimento otimizado utilizou 6 g de leite, 3 mL de água, 6 mL de acetonitrila contendo 1% de ácido acético, 2,4 g de MgSO4 e 0,6 g de acetato de sódio, sendo que na etapa de clean up da amostra utilizou-se 37,5 mg de amina primária e secundária, 25 mg de octadecilsilano e 150 mg de MgSO4. O planejamento experimental foi considerado eficiente na otimização das condições cromatográficas e no procedimento de extração QuEChERS, obtendo-se boa separação entre os picos e valores de recuperação entre 95 e 98%, com desvio padrão relativo inferior a 8,25% para os analitos na concentração de 0,05 mg kg-1. No desenvolvimento do método de extração SPE não foi possível obter boa recuperação dos analitos e clean up da amostra. Acredita-se que as sulfonamidas estudadas sejam perdidas na etapa de pré-tratamento do leite, a qual é importante para a realização da SPE. Desse modo, a extração usando o QuEChERS foi selecionada para a análises das sulfonamidas em leite bovino. Os ensaios de validação demonstraram que o método é adequado para a análise das sulfonamidas, dentro do limite máximo de resíduos (0,1 mg kg-1), estabelecido pela Agencia Nacional de Vigilância Sanitária, com exatidão e precisão dentro da faixa aceitável pelos guias de validação seguidos. Além disso, foi possível utilizar apenas etanol e água como fase móvel cromatográfica, o que é uma vantagem em relação a métodos tradicionais, pois utiliza um solvente orgânico menos tóxico e renovável. A vazão de fase móvel é relativamente baixa, o que contribui para a diminuição do volume de solvente orgânico consumido e de resíduos gerados.The use of veterinary medicines is of great importance in animal production, but also can have negative consequences, such as the occurrence of residues in food of animal origin, among which bovine milk stands out. Sulfonamides are an antibiotic class used in animal and human treatments, so it is important to analyze this kind of residue in food of animal origin, such as milk, because it can cause allergic reactions and poisoning, affecting food safety and damaging the manufactory of dairy products. Most of the studies have used solid-phase extraction (SPE) in the extraction of sulfonamides and clean up of the sample. However, the QuEChERS method, introduced in 2003, has been considered promising in the extraction of various compounds in food matrices. Thereby, this research aimed to develop and validate analytical methods comparing the extraction methods SPE and QuEChERS, followed by high performance liquid chromatography with diode array detection for the analysis of sulfonamides (sulfathiazole, sulfamethazine and sulfadimethoxine) in bovine milk. In the optimization of the chromatographic conditions and QuEChERS method, we used experimental design. Chromatographic conditions were optimized, selecting column C18 Luna (100 x 4.6 mm, 5 µm), injection volume of 17 µL, wavelength of 290 nm, flow rate of 0.5 mL min-1, temperature of 20 °C and gradient mode, using water and ethanol as mobile phase. In the QuEChERS method, the optimized procedure used 6 g of milk, 3 mL of water, 6 mL of acetonitrile with 1% of acetic acid, 2.4 g of MgSO4 and 0.6 g of sodium acetate, and in the clean up step it was used 37.5 mg of primary and secondary amine, 25 mg of octadecylsilane and 150 mg of MgSO4. Experimental design was considered efficient in the optimization, since it was obtained good separation of the chromatographic peaks and recovery between 95 and 98% with relative standard deviation below 8.25% for the analytes in the concentration of 0.050 mg kg-1. In the development of the extraction method SPE, it was not possible to obtain good recovery for the analytes and clean up of the sample. It is believed sulfonamides are lost in the sample pre-treatment step, which is important in performing SPE. Therefore, the QuEChERS method was selected for this analysis. The validation tests demonstrate the method is appropriate, within the maximum limit residue (0.1 mg kg-1), established by the National Health Surveillance Agency, with accuracy and precision within the accepted limit, according to the followed validation guides. Moreover, it was possible to use just water and ethanol as mobile phase, what is an advantage in relation to traditional methods, because it uses an organic solvent less toxicant and renewable. Rate flow is also relatively low, which contributes to decrease the required volume of organic solvent and the amount of waste produced