Histological study of implanted perifascial areolar tissue in rabbit´s vocal folds

Apesar do grande avanço da laringologia nas últimas décadas, o tratamento da rigidez da prega vocal continua sendo um desafio. A rigidez da prega vocal pode estar associada a alterações estruturais mínimas como no sulco vocal profundo ou decorrente da fibrose cicatricial como nos casos de cicatriz pós-operatória. Em ambos os casos, há perda dos elementos da matriz extracelular da camada superficial da lâmina própria (Espaço de Reinke) que se encontra substituída por tecido cicatricial. O objetivo do tratamento é recuperar a deficiência volumétrica e restabelecer a microarquitetura histológica da prega vocal. O tecido areolar perifascial constitui uma excelente alternativa por suas propriedades viscoelásticas semelhantes à da camada superficial da lâmina própria, por sua fácil obtenção e baixo custo. O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações histológicas que ocorrem no enxerto e na prega vocal enxertada e comparar os resultados encontrados com a prega vocal contralateral, submetida apenas à manipulação cirúrgica. Trinta coelhos foram submetidos ao procedimento cirúrgico que consistiu na confecção de um bolsão na lâmina própria de ambas as pregas vocais. O enxerto foi colocado na prega vocal direita e a prega esquerda utilizada como controle. Os animais foram divididos randomicamente em três grupos diferindo no tempo da análise histológica: 15 dias (Grupo I), três meses (Grupo II) e seis meses (Grupo III). As lâminas foram coradas com hematoxicilina-eosina e pelo Sírius-red, uma coloração específica para fibras colágenas. Observou-se uma mudança gradual do enxerto com aumento progressivo da densidade das fibras colágenas no interior do enxerto e uma mudança progressiva do padrão de birrefringência das mesmas, de um predomínio de fibras colágenas amarelo-esverdeadas para um predomínio de fibras laranja-avermelhadas. A laplicação do teste estatístico Anova one-way mostrou um aumento estatisticamente significativo da densidade de colágeno total no interior do enxerto entre os animais dos Grupos I e II (p=0,004) e um aumento significativo da porcentagem de fibras laranja-avermelhadas entre o Grupo II e III (p=0,011). A densidade do colágeno na região adjacente ao enxerto na prega vocal enxertada foi estatisticamente maior que a densidade de colágeno na incisão cirúrgica na prega vocal controle em todos os grupos de estudo (p 0,001). A aplicação do Teste de Fisher na análise semiquantitativa do processo inflamatório não evidenciou diferença estatisticamente significativa entre a prega vocal enxertada e a prega vocal controle em nenhum dos tempos estudados. Entretanto, quando avaliamos o processo inflamatório temporalmente para cada prega vocal evidenciamos uma diminuição significativa do processo inflamatório entre os animais do grupo de 15 dias e três meses (p=0,032 para o grupo enxertado e p=0,035 para o grupo controle). Nossos achados sugerem que o tecido areolar perifascial apresenta baixa tendência a promover reação inflamatória e permanece na prega vocal do coelho por pelo menos seis meses. Entretanto, há uma importante mudança da composição do colágeno dentro do enxerto e no tecido ao redor deste sugerindo não ser um tecido ideal para substituir a lâmina própria. Outros estudos devem ser realizados para avaliar o seu papel no tratamento da rigidez da prega vocal.Besides the great development of phonosurgery over the previous decades, vocal fold stiffness is a difficult disease that remains a therapeutic challenge. It may be either caused by cicatricial fibrosis or be associated with minor structural alterations of the vocal fold mucosa, mainly represented by deep sulcus vocalis. In both cases, there is loss and disorganization of extracellular matrix components of the superficial layer of the lamina propria (Reinkes Space), which is replaced by fibrotic tissue. The treatment goal is to re-establish the physical volume and the microarchitecture of the vocal folds. The perifascial tissue consists of a loose areolar tissue with viscoelasticity properties close to those of the superficial layer of the lamina propria. Thus, the aim of this experiment was to evaluate the histological changes of the graft and in the host tissue after placing a strip of this tissue into rabbits vocal folds. Thirty rabbits were operated. The graft was implanted in pockets surgically created in the right vocal fold. The left vocal fold was used as control. The animals were randomically divided in three groups for evaluation at 15 days (Group I), 3 months (Group II) and 6 months (Group III) and their larynx reviewed histologically. Histological sections underwent hematoxylin-eosin and specific staining method to quantify collagen fibers (Picrosirius-polarization method). Histological changes of the graft were observed since 15 days post-operatively and were characterized by a progressive increase of the density of collagen fibers and decrease of vascularization. Examination of Picrosirius-red stained section with polarizing microscopy revealed a gradual change of collagen fibers pattern with a predominance of greenish-yellow range observed in the original tissue and in Group I and mostly redish-orange range in the grafts of Group II and III. Statistical analysis (Anova one-way) showed a significant increase of the liitotal collagen density in the graft between Group I and II (p=0.004) and a significant predominance of redish-orange pattern between Groups II e III (p=0.011). The collagen density of the surrounding area of the graft in the implanted vocal fold was significantly increased when compared to control in all periods (p 0.001). The inflammatory process was not statistically different between the implanted vocal folds and controls according to Fisher´s test for any of the studied groups. Nonetheless, when the inflammatory process of each vocal fold was individually assessed on a long-term basis, a significant decrease of the inflammatory process was seen in the host (p=0.032) and control vocal fold (p=0.035) between Group I and II. Our findings suggest that the PAT has some advantages as a substance for vocal fold augmentation: it has low tendency to promote inflammatory response and low rate of absorption since it remains in the vocal fold for at least six months. However, the histological changes that take place in the graft and in the host tissue suggest that the PAT is not an ideal material as a substitute for the lamina propria and new studies are needed to determine its role on the treatment of vocal fold scarring