Evaluation of the interaction between Methylobacterium spp. and citrus

A interação bactéria-planta é um processo complexo que envolve diversos fatores bióticos e abióticos, podendo resultar em interações neutras, benéficas ou patogênicas. O gênero Methylobacterium tem sido descrito como endófito em diferentes plantas hospedeiras, podendo beneficiá-las por meio da promoção de crescimento vegetal e do controle de fitopatógenos. Em citros, este endófito coloniza o mesmo nicho que patógenos, e, assim, muitas espécies desse gênero são interessantes candidatas ao controle simbiótico contra Xylella fastidiosa. É conhecido que o processo de interação Methylobacterium-bactéria é coordenado por genes cuja expressão é regulada pelo sistema Quorum Sensing (QS), o qual utiliza N-acil-homoserina lactonas (AHLs) como moléculas sinalizadoras, importantes, entre outras coisas, para a formação de biofilme, encontrado em muitas plantas como estratégia de colonização bacteriana. No entanto, os mecanismos envolvidos na interação Methylobacterium-planta são ainda pouco compreendidos. Dessa forma, o presente trabalho buscou estudar, de diferentes maneiras, a interação entre Methylobacterium spp. e citros, avaliando os efeitos dessas bactérias sobre o crescimento de plântulas e a variação da expressão gênica. Neste contexto, foi verificado que a especificidade da interação bactéria-planta e a escolha do método de inoculação das bactérias são importantes para a geração de resultados benéficos sobre a germinação de sementes e o desenvolvimento da planta hospedeira. Possivelmente, a produção de AIA e a fixação biológica de nitrogênio foram os mecanismos envolvidos na promoção de crescimento de citros por Methylobacterium spp. neste estudo. Com relação à origem, essas bactérias parecem ser transmitidas horizontalmente em plantas cítricas. Visando empregar Methylobacterium spp. no controle de fitopatógenos em citros, M. extorquens AR1.6/2 foi geneticamente modificada para expressar uma endoglicanase A (EglA). Por meio de microscopia eletrônica de varredura, foi verificado que a bactéria modificada colonizou a superfície e o interior de Catharanthus roseus, planta modelo para experimentos com bactérias endofíticas e X. fastidiosa. Além disso, quando inoculada junto com X. fastidiosa, essas bactérias compartilharam o xilema das plântulas, sugerindo que durante a colonização e estabelecimento no hospedeiro estas bactérias poderiam interagir. Estudando a ação de uma AHL sobre a expressão de genes envolvidos na interação entre M. mesophilicum SR1.6/6-planta, foi observado que a presença dessa molécula foi importante na ativação da expressão dos genes mxaF, relacionado ao estabelecimento e metabolismo metilotrófico da bactéria; pat, relacionado a vantagens adaptativas e competitivas durante a colonização da planta; e acdS, envolvido com o metabolismo bacteriano e modulação de níveis hormonais na planta. A expressão dos genes crtI e sss, envolvidos com respostas a estresse e transporte de compostos, respectivamente, e do gene phoU, relacionado com patogenicidade, não foram alterados na presença da AHL nas condições avaliadas Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que Methylobacterium spp. interagem com plântulas de Citrus spp., demonstrando especificidade entre a espécie de planta e da bactéria endofítica. Foi observado também que esta interação ocorre não somente com a planta, mas possivelmente com outras bactérias que habitam o xilema de citros. Além disso, esta interação Methylobacterium-citros-bactérias do xilema pode ser regulada por AHLs.The bacterium-plant interaction is a complex process that involves several biotic and abiotic factors that may result in neutral, beneficial or harmful interactions. The Methylobacterium genus has been described as endophytic bacterium in different host plants. It could benefit the plants by growth promotion and control of phytopathogens. In citrus, this endophyte colonizes the same pathogen-niche, and therefore many species of this genus are interesting candidates to symbiotic control against X. fastidiosa. It is known that the process of Methylobacterium-bacteria interaction is coordinated by genes whose expression is regulated by the Quorum Sensing (QS), which uses N-acyl homoserine lactones (AHLs) as signaling molecules. Its importance is associated with the biofilm formation, found in many plants as a strategy for bacterial colonization. However, the mechanisms in Methylobacterium-plant interactions are still poorly understood. Thus, this work studied in different ways, the interaction between Methylobacterium spp. and citrus, evaluating the effects of these bacteria on the seedling growth and the variation of gene expression. In this context, it was found that the specificity of bacteria-plant interactions and the bacterial inoculation methods are important to generate beneficial results on seed germination and host plant development. Possibly, IAA production and nitrogen biological fixation were the major involved mechanisms in citrus growth promotion by Methylobacterium spp. These bacteria seem to be transmitted horizontally in citrus plant. Aiming to employ Methylobacterium spp. to control phytopathogens in citrus plant, M. extorquens AR1.6/2 was genetically modified to express an endoglucanase A (EglA) enzyme. Using scanning electron microscopy was observed that the modified bacteria colonized the surface and interior of the Catharanthus roseus, a model plant for experiments with endophytic bacteria and X. fastidiosa. Furthermore, when inoculated with X. fastidiosa, these bacteria shared the seedlings xylem, suggesting that during the colonization and establishment in the host, these bacteria could interact. Studying the action of a AHL on the expression of genes involved in the interaction between M. mesophilicum SR1.6/6- plant it was observed that the presence of this molecule was important in the activation of genes expression mxaF (related to the establishment and methylotrophic metabolism); pat (related to adaptive and competitive advantages during the plant colonization); acdS (involved in bacterial metabolism and modulation of hormone levels in the plant). Expression of crtI and sss, involved in bacterial stress and transport of compounds, respectively, and phoU, related with pathogenicity were not altered in the presence of AHL in the evaluated conditions. The results of this study demonstrated that Methylobacterium spp. interact with seedlings of Citrus spp., showing specificity between plant species and endophytic bacteria. Also, it was observed that this interaction occurs not only with the plant molecular modification levels, but possibly with other bacteria that inhabit the xylem of citrus. Also, this interaction Methylobacteriumcitrus- xylem bacteria may be regulated by AHLs