Selection of commercial lipase preparations for interesterification of milkfat with soybean oil

O presente projeto teve como objetivo selecionar lipases comerciais para a interesterificação enzimática da gordura do leite com óleo de soja visando à obtenção de produto enriquecido com ácidos graxos essenciais. Foram testadas lipases de diferentes fontes microbianas (Aspergillus niger, Mucor javanicus, Rhizopus oryzae, Candida rugosa, Penicillium roqueforti e Rhizomucor miehei) imobilizadas em matriz híbrida polissiloxano-álcool polivinílico (POS-PVA) previamente caracterizada quanto às suas propriedades físicoquímicas e morfológicas. Tanto as enzimas livres como imobilizadas, foram inicialmente caracterizadas com relação às suas atividades hidrolítica e de esterificação. Em função da alta complexidade das matérias-primas \"gordura do leite e óleo de soja\", optou-se pela triagem inicial da enzima em um sistema reacional modelo de interesterificação. Como reagentes de partida, foram escolhidos tripalmitina e trioleína, uma vez que os ácidos graxos palmítico e oléico estão presentes em grande quantidade nos triglicerídeos que compõem as matériasprimas de interesse. Assim, as lipases imobilizadas no suporte POS-PVA foram empregadas na catálise de reações de interesterificação no sistema modelo empregando-se hexano como solvente. O valor mais elevado de rendimento de interesterificação (31%) foi obtido com o emprego da lipase de Rhizopus oryzae (L036P), sendo esta enzima selecionada para continuidade do trabalho. Testes adicionais foram efetuados para verificar a influência da concentração de trioleína e tripalmitina no rendimento da reação. Neste caso, o melhor resultado foi alcançado no substrato equimolar de tripalmitina e trioleína (40mM), para o qual observou-se um rendimento de interesterificação de 45%, em 24 h de reação. O sistema imobilizado selecionado foi caracterizado quanto às suas propriedades físico-químicas e de estabilidade, empregando-se técnicas como difratometria de raios-X e espectroscopia no infravermelho. Foi observada boa estabilidade à estocagem, mantendo-se 100% da atividade hidrolítica inicial após 120 dias de armazenamento. Finalmente, foram realizados testes de interesterificação da gordura do leite com óleo de soja sendo que, de maneira geral, a lipase de Rhizopus oryzae imobilizada em POS-PVA promoveu o aumento na concentração dos triglicerídeos C26-C34 e C46-C50, e diminuição dos triglicerídeos C38, C44 e C54, obtendo-se 12% de rendimento de interesterificação. A análise de textura do meio reacional e do produto interesterificado mostrou que a simples mistura física de óleo de soja com a gordura do leite provocou uma diminuição de mais de 50% na consistência desta gordura. Após a reação de interesterificação, o produto obtido apresentou redução de aproximadamente 24 % na consistência em relação à da mistura física das matérias-primas, devido à incorporação dos ácidos graxos insaturados do óleo de soja nos triglicerídeos presentes na gordura do leite, e à formação de mono e diglicerídeos devida à hidrólise parcial das matérias-primas. Assim, os resultados promissores obtidos com o uso da lipase de Rhizopus oryzae (L036) imobilizada em POS-PVA, tanto na reação modelo de interesterificação de tripalmitina com trioleína quanto nas matérias-primas lipídicas, possibilitaram a seleção deste sistema enzimático visando ao seu emprego no bioprocesso de interesse.The objective of this work was to select a commercial lipase for enzymatic interesterification of milkfat with soybean to obtain a product enriched with essential fatty acids. Lipases from different microbial sources (Aspergillus niger, Mucor javanicus, Rhizopus oryzae, Candida rugosa, Penicillium roqueforti, Rhizomucor miehei) were immobilized on polysiloxane- polyvinyl alcohol hybrid matrix (POS-PVA) previously characterized in relation to its physico-chemical and morphological properties. All lipase preparations in both free and immobilized forms were initially characterized, regarding their hydrolytic and esterification activities. Owing to the high complexity of the raw materials \"milkfat and soybean oi\", the lipase screening assay was carried out using a model interesterification system consisted of tripalmitin and triolein. These triglycerides were chosen as starting materials since palmitic and oleic fatty acids are present at high amount proportions in the raw materials. Thus, immobilized lipase derivatives on POS-PVA were used to catalyze the interesterification of tripalmitin with triolein in the presence of hexane as solvent. The highest interesterification (31%) was obtained using the lipase from Rhizopus oryzae (L036P) and therefore, this enzyme was selected for continuing the work. Additional tests were performed to verify the influence of the molar ratio between triolein and tripalmitin in the reaction yield. The best result was achieved for the substrate containing equimolar amounts of tripalmitin and triolein (40 mM), attaining 45% of interesterification yield at 24 h reaction. The selected immobilized system was characterized in relation to its physico-chemical and stability properties using techniques as X-ray difractometry and IR spectroscopy. High stability was found for the immobilized lipase that maintained full original activity after 120 days storage at 4?C. Finally, interesterification tests of milkfat with soybean oil were carried out, and the use of Rhizopus oryzae lipase immobilized in POS-PVA increased the concentration of the triglycerides C26- C34 and C46-C50, and decreased the concentration of the triglycerides C38, C44 and C54, which corresponded to 12% of interesterification yield. The texture analysis of both reaction medium and interesterified product showed that simple physical blend of soybean oil with milk fat reduced more than 50% the milkfat consistency. After the interesterification reaction, the obtained product showed even lower consistency (24% reduction) in comparison with the physical raw materials blend, due to the incorporation of unsaturated fatty acids from soybean oil in the triglycerides of milkfat, and to the formation of mono and diglycerides resulting from partial hydrolysis of the raw materials. Thus, the promising results obtained using Rhizopus oryzae lipase (L036P) immobilized on POS-PVA, both in the model interesterification reaction of tripalmitin with triolein and in the lipid raw materials, indicated the suitability of the selected immobilized derivative to be applied in the proposed bioprocess