Identification of genetic signatures in coding region of the small subunit ribosomal RNA of Cryptosporidium spp.: molecular characterization of samples from mammals and birds

Este trabalho teve como objetivos a identificação de sequências 18S rDNA amplificadas de Cryptosporidium spp. de diversas espécies de hospedeiros e avaliar variabilidade em sequências gênicas deste lócus, com vistas ao desenho de sondas moleculares com melhor eficiência diagnóstica para detecção e identificação deste parasito. Foram coletadas 392 amostras de animais domésticos (bovinos, eqüinos, suínos, ovinos, cães e felinos) de 98 propriedades rurais do município de Teodoro Sampaio, Estado de São Paulo, 474 de aves silvestres de cativeiro de diversas famílias, provenientes de criadouros comerciais do Estado de São Paulo e criadas como estimação, 141 de sagüis de cativeiro do Estado de São Paulo, e 24 de humanos imunodeprimidos provenientes de hospital do município de São Paulo. As amostras foram submetidas a prova coproparasitológica e molecular para detecção e identificação de Cryptosporidium. Alinhamentos múltiplos obtidos de seqüências 18S rDNA de Cryptosporidium spp. determinadas neste estudo e de sequências recuperadas do Genbank foram analisados visualmente para a definição das regiões polimórficas. Após a definição das regiões polimórficas, foram realizadas análises filogenéticas empregando-se separadamente cada uma delas. Pelo exame coproparasitológico foi encontrado positividade em amostras de nove (4,57%) bovinos, três (11,11%) cães, 41 (8,64%) aves silvestres, 13 (9,20%) sagüis e todas as de humanos. As outras espécies de animais domésticos não apresentaram positividade para o parasita no exame coproparasitológico. Nos bovinos foi encontrado o Cryptosporidium Andersoni, em cães o Cryptosporidium canis, em sagüis o Cryptosporidium parvum e em humanos, C. parvum, Cryptosporidium hominis, Cryptosporidium felis e C. canis. Dentre as amostras de aves nenhuma foi identificada como Cryptosporidium meleagridis. As amostras de curiós (Oryzoborus angolensis) foram classificadas como Cryptosporidium galli, com exceção de uma, identificada como Cryptosporidium baileyi. C. galli foi encontrado também em um Sabiá Laranjeira (Turdus rufiventris), um Picharro (Saltator similis), dois canários e um Pintassilgo (C. carduelis). C. baileyi foi encontrado em um pintassilgo (Carduelis carduelis) um Pichochó (Sporophila frontalis), um Galo da Campina (Paroaria dominicana) e dois Canários (Sicalis flaveola). Pelos resultados, duas regiões polimórficas em sequência 18S rDNA de Cryptosporidium spp. (denominadas regiões 1 e 3) permitiram discriminar as diferentes espécies neste gênero de parasita, podendo ser utilizadas isoladamente como marcadores moleculares para identificação molecular dentro deste gênero. Saguis (Chalitrix spp.) de cativeiro são espécies susceptíveis a infecção por Cryptosporidium parvum apresentando-se como um hospedeiro de importância epidemiológica para esta zoonose. Curiós (O. angolensis) de cativeiro são espécies susceptíveis a infecção por Cryptosporidium galli apresentando-se como hospedeiro de importância epidemiológica para esta espécie de parasito. A não detecção de Cryptosporidium parvum em animais domésticos na região de Teodoro Sampaio, Estado de São Paulo, mostra uma condição sanitária favorável, já que este agente é causador de importante zoonose. A presença de espécies de Cryptosporidium spp. adaptadas a animais domésticos (como o C. felis e o C. canis) em humanos na cidade de São Paulo mostra que estes animais podem desempenhar importante papel na cadeia epidemiológica da criptosporidiose humana.The objectives of this study were to identify 18S rDNA sequences of Cryptosporidium spp. From various species of hosts and to avaluate the variability in gene sequences of this locus, aiming the design of molecular probes with better diagnostic efficiency for the detection and identification of this parasite. It was collected 392 samples of domestic animals (cattle, horses, pigs, sheeps, dogs and cats) of 98 rural properties of Teodoro Sampaio city, São Paulo State, 474 captive wild birds of various families, from pet and comercial breeding in São Paulo State, 141 captive marmosets, of São Paulo State, and 24 immunossupressed humans from a São Paulo city hospital. The samples were submitted to coproparasitological and molecular tests for the detection and identification of Cryptosporidium. Multiple alignment of Cryptosporidium 18S rDNA sequences, that was determinated in this study and other download from GenBank were visually inspected in order to define polymorphic regions. After the definition of polymorphic regions, phylogenetic trees were reconstructed using each polymorphic region. Cryptosporidium spp. Were found by using coproparasitological tests in nine (4,57%) samples of cattle, tree (11,11%) dogs, 41 (8,64%) wild birds, 13 (9,20%) marmosets and all human samples. The other animal species were negative by coproparasitological tests. In cattle it was found Cryptosporidium andersoni, in dogs Cryptosporidium canis, in marmosets Cryptosporidium parvum and in humans, C. parvum, Cryptosporidium hominis, Cryptosporidium felis e C. canis. Among the samples of birds Cryptosporidium meleagridis was not found. All the samples of lesser seed-finch (Oryzoborus angolensis) were classified as Cryptosporidium galli, except for that from one individual with was identified as Cryptosporidium baileyi. Cryptosporidium galli was also found in one rufous-bellied thrush (Turdus rufiventris), one green-winged saltator (Saltator similis), two saffron finch (Sicalis flaveola) and one eurasian goldfinch (Carduelis carduelis). C. baileyi was found in one eurasian goldfinch (C. carduelis), one buffy-fronted seedeater (Sporophila Frontalis), one red-cowled cardinal (Paroaria dominicana) and two saffron finch (S. flaveola). From the results two polymorphic regions within 18S rDNA sequences of Cryptosporidium spp. (named as regions 1 and 3) enabled the discrimination of the different species in this genera, and then could be used alone as molecular markers for identification within this genera. Captive marmosets (Chalitrix spp.) are susceptible species for Cryptosporidium infection, presenting itself as an important source of infection for this zoonosis. Captive lesser seed-finch (Oryzoborus angolensis) are susceptible species for Cryptosporidium galli infection presenting itself as an epidemologic important host for this parasite. The absence of Cryptosporidium parvum in domestic animals of Teodoro Sampaio, São Paulo State, is indicative of a favorable health condition, as C. parvum is an agent causative of an important zoonosis. The presence of Cryptosporidium spp. species adapted to domestic animals (as C. felis and C. canis) in humans at São Paulo State indicate that these animals could play an important role in the epidemiology of human cryptosporidiosis