Enzymatic behavior of four lignocellulolytic fungi grown on sugarcane bagasse and straw, exposed to two concentrations of nitrogen, aiming the production of ethanol

Estima-se que o Brasil produza no ano de 2010 cerca de 160 milhões de toneladas de bagaço e palha de cana-de-açúcar. O bagaço é um subproduto decorrente do esmagamento da cana, constituído por fibras, partículas de terra e resíduos de caldo. A palha é o material remanescente encontrado na superfície da área plantada, após a colheita, constituída por frações de folhas, ponteiros, colmos e raízes. Estes subprodutos são utilizados como fonte de energia dentro das próprias usinas e destilarias. Porém, com o interesse mundial voltado para o uso de outras fontes de energia, além do petróleo, a importância do emprego destes substratos na produção de etanol, aumentou. As fibras presentes nestes subprodutos são constituídas principalmente por celulose, hemicelulose e lignina. Os mecanismos enzimáticos envolvidos na degradação destes materiais, resultando na conversão da biomassa em produtos de alto valor agregado, são bastante complexos, necessitando da participação de enzimas lignocelulolíticas produzidas, sobretudo por fungos. Este estudo visou à caracterização enzimática lignocelulósica e a liberação de açúcares redutores por fungos ligninolíticos e celulolíticos, expostos a duas concentrações de nitrogênio e o comportamento destes organismos perante situação de estresse nutricional. Os fungos utilizados foram Pleurotus sajor caju, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei e Aspergillus niger, selecionados em trabalhos anteriores. Estes organismos foram inoculados em frascos Erlenmeyers, contendo bagaço e palha de cana pré-tratados com H2SO4 (0,5%) e duas concentrações de nitrogênio (0,5% e 1% de extrato de levedura), por 15 dias. Diariamente, foram coletadas amostras e analisadas quanto à concentração de proteínas, atividade específica de Lacase, Peroxidases, Manganês peroxidase, Endoglicanases, atividade celulolítica total, Superóxido dismutase (SOD), Catalase (CAT) e quantificação de açúcares redutores. A enzima SOD foi analisada através de PAGE não desnaturante e o perfil protéico observado em SDS-PAGE. As demais análises foram realizadas em espectrofotômetro. O meio contendo 0,5% de extrato de levedura foi favorável ao crescimento dos fungos P. sajor caju e T. reesei, e o meio com 1% de extrato foi favorável à P. chrysosporium e A. niger. Quanto à produção das enzimas ligninolíticas (µmol.min-1.mg proteína-1), a maior produção de Lacase foi observada em P. sajor caju (2,2; 1%; 13º dia), de Peroxidases também para P. sajor caju (1,5; 1%; 12º dia) e MnP para T. reesei (0,172; 1%; 4º dia). A maior atividade celulolítica total (FPU.mg proteína-1) e de Endoglicanases (CMC.mg proteína-1) foi observada para T. reesei (10,1 e 20,6; 0,5%; 7º dia, respectivamente). Quanto à maior liberação de açúcares redutores, P. chrysosporium (0,757 mgAR.gBS-1; 1%; 9º dia). Foram observadas até quatro isoformas de SOD que variaram entre os fungos, concentrações de nitrogênio e dias. As maiores atividades de CAT (µmol.min-1.mgproteína-1) foram observadas para P. sajor caju (0,811; 5º dia), T. reesei (0,726; 1º dia), P. chrysosporium (0,441; 3º dia) e A. niger (0,194; 10º dia), todos na concentração de 0,5%. As espécies, as concentrações de nitrogênio e o período de incubação influenciaram no crescimento, nas atividades enzimáticas e na liberação de açúcares redutores dos fungosIt is estimated that Brazil will produce in 2010 about 160 million tons of sugarcane bagasse and straw. The bagasse is a byproduct resulting from the crushing of sugarcane, consisting of fibers, particles of dirt and waste broth. The straw is the material found on the surface of the remaining crop, after harvest, consisting of fractions of leaves, pointers, stems and roots. These products are used as an energy source within their own mills and distilleries. However, with the global interest focused on the use of other energy sources instead of petroleum, the importance of using these substrates in ethanol production increased. The fibers in these products are composed primarily of cellulose, hemicellulose and lignin. The mechanisms involved in enzymatic degradation of these materials, resulting in conversion of biomass into high value added products, are quite complex, requiring the participation of lignocellulolytic enzymes produced mainly by fungi. This study aimed to a lignocellulosic enzymatic characterization and the release of reducing sugars by ligninolytic and cellulolytic fungi exposed to two concentrations of nitrogen and the behavior of these organisms against a nutritional stress situation. The fungi used were Pleurotus sajor caju, Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei and Aspergillus niger, selected from previous work. These organisms were inoculated in Erlenmeyer flasks containing sugarcane bagasse and straw pretreated with H2SO4 (0.5%) and two concentrations of nitrogen (0.5% and 1% yeast extract) for 15 days. Daily samples were collected and analyzed for proteins concentration, specific activity of Laccase, Peroxidases, Manganese Peroxidase, Endoglucanases, total cellulolytic activity, Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and quantification of total sugar. The enzyme SOD was analyzed by native PAGE gels and the protein profile observed in SDS-PAGE. Other analyses were performed on a spectrophotometer. The medium containing 0.5% yeast extract was favorable to the growth of fungi P. sajor caju and T. reesei and the medium with 1% extract favored P. chrysosporium and A. niger. Regarding the production of lignilolytic enzymes (mol.min-1.mg protein-1), the highest activity of Laccase was found in P. sajor caju (2.2, 1%, 13 days), for Peroxidases also in P. sajor caju (1.5, 1%, day 12) and MnP in T. reesei (0.172, 1%, day 4). The highest total cellulolytic activity (FPU.mg protein-1) and Endoglucanases (CMC.mg protein-1) was observed for T. reesei (10.1 and 20.6, 0.5%, day 7, respectively). As for the highest release of total sugars, P. chrysosporium (0.757 mgAR.gBS-1, 1%, 9 day). It was observed up to four SOD isoforms that varied from fungi, nitrogen concentrations and days. The highest CAT activities (mol.min-1.mg protein-1) were observed for P. sajor caju (0.811, 5 days), T. reesei (0.726, day 1), P. chrysosporium (0.441, day 3) and A. niger (0.194, 10 days), all at 0.5% concentration. The species, nitrogen concentrations and the period of incubation influenced the growth, the enzymatic activity and the release of total sugars in the fung