Identification and characterization of a sugarcane promoter induced by herbivory

Uma fonte particularmente comum de injúrias em plantas são os insetos fitófagos. Ao se alimentarem, os insetos induzem um rápido acúmulo de proteínas de resposta ao ferimento ao longo da planta. Poucos trabalhos têm caracterizado a expressão de genes induzidos por insetos herbívoros. No caso de monocotiledôneas, praticamente estas informações são inexistentes. Desse modo, inicialmente foi caracterizada a expressão de genes de cana-de-açúcar (uma planta monocotiledônea) cujos ortólogos foram previamente reportados como responsivos ao ataque de pragas em dicotiledôneas. Assim sendo, foram feitos ensaios de indução da expressão de genes por hebivoria utilizando lagartas de Diatraea saccharalis. A análise da expressão dos genes nas plantas de cana foi realizada por Northern Blot utilizando-se como sondas sequências expressas (ESTs) obtidas no banco de dados do Projeto SUCEST/FAPESP. Foram utilizadas as seguintes sondas: polifenol oxidase (PPO), lipoxigenase (LOX2), metalotioneína (MT1), proteína tipo heveína (HEL), a cistatina (CIS) e a β-actina como controle interno. Os resultados mostraram que os genes PPO e HEL tiveram sua expressão significativamente aumentada (de 10 a 12 vezes) em relação ao controle. A expressão dos genes CIS, MT1 e LOX2 também foi aumentada, apesar de ser inferior aos genes PPO e HEL. Com base nos estudos de expressão foram escolhidos os genes HEL e PPO para a identificação e caracterização de promotores de cana-de-açúcar induzidos por herbivoria. Uma vez clonada a região promotora do gene HEL de aproximadamente 1100 pb, foram feitos buscas de seqüências regulatórias que revelaram a presença de seqüências relacionadas à defesa de plantas. Em seguida três deleções a partir da extremidade 5 nessa região foram realizadas e fusionadas de forma a dirigirem a expressão do gene repórter uidA (GUS). Essas construções foram expressas em plantas de cana-de-açúcar, a fim de estudar sua regulação em resposta a hebivoria. Os resultados mostraram que a região promotora é positivamente regulada por hebivoria. Os resultados desse estudo contribuem para novas perspectivas na expressão heteróloga de genes com propriedades inseticidas em cana-de-açúcar.A particularly common source of wounding in plants is caused by herbivore insects. ln monocotyledonous plants, the defense mechanisms against herbivores are still poorly understood and few studies have addressed the expression of genes induced by herbivore insects. ln the present study it has been characterized the sugarcane responses to the attack of the sugarcane borer (Diatraea saccharalis) by analyzing the expression of a set of genes whose orthologues have been shown to be related to insect attack in dicotyledonous plants. Gene expression analysis was performed by Northern Blot. The following Expressed Sequence Tags (ESTs) obtained from the cluster consensi bank of Sugarcane EST Transcriptome Project (SUCEST) were used as probes: polyphenol oxidase (PPO), lipoxygenase (LOX2), hevein-like protein (HEL), cystatin (CYS) and β-actin (internal control). The results showed that PPO and HEL gene expression increased by 10 to 12- fold in relation to the control. The expression of CYS, MT1 and LOX2 genes were also increased, although as not as the same extent for PPO and HEL genes. Based on these expression studies the cloning of the HEL and PPO promoter regions was attempted. After cloning a 1100 bp fragment corresponding to the 5 upstream region of the sugarcane HEL coding sequence, the search for regulatory sequences involved on plant defense was performed. Soon after three deletions of the promoter region were carried out and the resulting fragments were fused to the uidA (GUS) reporter gene. These gene constructs were expressed in sugarcane plants in order to study its regulation in response to hebivory. The results showed that the promoter region is positively regulated by hebivory. The results of that study bring new insights on heterologous expression of insect resistant genes in sugarcane plants