Development of methodology for obtaining somatic embryogenesis on grapevine

Visando a obtenção de um protocolo de desenvolvimento in vitro de embriões somáticos de videira para utilização em Programas de Melhoramento Genético, realizou-se este trabalho buscando verificar: a) o substrato mais adequado para a brotação rápida e uniforme de estacas de videira sendo as brotações uma das fontes de explantes para os experimentos e b) o explante e meios de cultura mais adequados para a obtenção de embrióides in vitro. Para atender ao primeiro objetivo, efetuaram­se 4 experimentos com estacas com forçamento de brotação, sendo que o primeiro com o cultivar IAC 457-11 Iracema e os demais com o cultivar IAC 514-5 Maria. No primeiro experimento testaram-se em relação ao controle (água) os seguintes substratos em solução aquosa: a) cianamida hidrogenada (245,0; 367,5 e 490,0ppm); b) 6-BA (10, 15, 20 e 25μM). No segundo experimento os substratos testados foram: a) NAA (200ppm); b) GA3 (20ppm) ; c) cianamida hidrogenada (9,8ppm); d) calciocianamida (200ppm) e 6-BA (100ppm). No terceiro experimento, os substratos testados foram: a) 6-BA (20ppm); b) calciocianamida (20ppm) e c) NAA (20ppm). No quarto experimento testou-se apenas a 6-BA (10 e 20ppm.). No terceiro experimento verificou-se também o efeito da extensão da área transversal das estacas da videira 'Maria' na rapidez de brotação dessas estacas. Para atender ao segundo objetivo estudaram-se vários explantes: óvulos não fertilizados, anteras e plântulas em combinação com diversos procedimentos de cultura, que incluíram condições ambientais de incubação, tipo e constituição de meios de cultura. Os meios de cultura básicos utilizados foram os de NN e MS. Dos experimentos com estacas com forçamento de brotação concluiu-se que para uma brotação rápida e homogênea de estacas de videira 'Maria' em laboratório, foi importante utilizar-se estacas estocadas a frio, com uma área transversal apenas água. Nos experimentos com cultura de anteras verificou-se que a 6-BA, independentemente da concentração utilizada, foi um regulador vegetal essencial para a produção de calos. No que diz respeito à auxina NOA, as concentrações de 0,0; 0,5 e 1,0ppm foram mais adequadas para a produção de calos do que as concentrações mais elevadas de 1,5 e 2,0ppm utilizadas. Neste trabalho, a embriogênese somática foi obtida com um tipo de explante ainda não descrito na literatura, ou seja, plântulas de videira 'Maria', desprovidas de raízes, provenientes de cultura in vitro de ápices meristemáticos de caule. Embrióides foram obtidos quando esses explantes foram inoculados em meio de cultura sólido (como se estivessem sendo plantados) que constou do meio básico de NN, acrescido de 1,5 ppm de NOA e 0,4ppm de 6-BA, após incubação no escuro por dois meses.This research work was carried out in order to obtain a series of in vitro development procedures for grapevine somatic embryogenesis as an aim to genetic breeding programmers. The main objectives were: a) the best substrate to promote fast and uniform grapevine woody stems cuttings bud bursting, being these buds one of the sources of explants for the experimentation, and b) the best explant and culture medium to induce in vitro embryoids. To attain the first objective, four experiments were done using grapevine woody stems cuttings submitted to forced bud bursting: the first one with the cultivar IAC 457-11 Iracema and the others with the cultivar IAC 514-6 Maria. In the first experiment the following water solution substrates were tested against the control: a) hydrogen cyanamide (245.0, 357.5 and 490.0ppm); b) 6-BA 10, 15, 20 and 25μMD. In the second experiment the substrates tested were: a) NAA (200ppm); b) GA3 (20ppm); c) hidrogen cyanamide (9,8ppm); d) calcium cyanamide (200ppm) and e) 6-BA(100ppm). ln the third experiment, the substrates tested were: a) 6-BA (20ppm.); b) calcium cyanamide (20ppm) and NAA (20ppm). ln the fourth experiment only 6-BA (10 and 20ppm) was tested. ln the third experiment, the effect of transversal area size of 'Maria' grapevine woody stems cuttings on bud bursting fastness was also studied. To attain the second objective of this work, several explants were studied, namely, non-fertilized ovules, anthers and plantlets combined to several culture procedures, including environmental incubation conditions and culture medium composition. The basic culture media used were NN and MS's. Results from experiments with woody stems cuttings submitted to forced bud bursting allowed to conclude that for fast and uniform woody stems cuttings bud bursting of grapevine cultivar 'Maria', in the laboratory, it was important to use cold stored woody stems, with an average transversal area of 59.5mm2, using only water substrate. ln the experiments with anther culture it was verified that 6-BA, regardless of its concentration, was an essential growth regulators for callus production. With regard to the NOA auxin, low concentrations of this growth regulator (0.0, 0.5 and 1.0ppm) were better for callus production than the higher ones (1.5 and 2.0ppm). In this work somatic embryogenesis was obtained with a kind of explant not yet described in the literature, that is rootless plantlets of 'Maria' grapevine cultivar, from in vitro culture of shoot apex. Embryoids were obtained when those explants were cultivated in solid culture medium (simulating their planting in the medium) made up of basic medium NN plus NOA (1.5ppm) and 6-BA (0.4ppm) after dark incubation for two months