Nucellar tissue culture, isolation and radiosensitivity of protoplasts in Citrus sinensis (L.) Osbeck cv. Pera

O longo período de juvenilidade, a alta heterozigosidade, a escassez de conhecimentos sobre o modo de herança de muitas características de interesse, a auto-incompatibilidade, a esterilidade e a embrionia nucelar são sérios obstáculos para os programas de melhoramento das espécies cítricas. Uma abordagem recente para o melhoramento genético é baseada na cultura de tecidos, incluindo o uso de protoplastos, a mutagênese in vitro e a seleção in vitro de características desejadas. No presente trabalho, foram estudados os fatores envolvidos na obtenção de calos embriogênicos de Citrus sinensis cv. Pera. Foram cultivados nucelos e óvulos extraídos de frutos de diferentes idades após a antese, em quatro diferentes meios de cultura e nas condições de escuro e de luminosidade. Os explantes desenvolveram embrióides e plântulas, os quais originaram calos embriogênicos a partir da região do hipocótilo. Os nucelos apresentaram as maiores percentagens de formação de calos embriogênicos nas diversas condições de cultivo testadas. O aparecimento e a proliferação, o dos calos embriogênicos ocorreram em meios de cultura sem horm6nios vegetais. O uso do 2,4-D nos meios de cultura resultou na inibição da embriogênese nucelar in vitro. Houve o surgimento de calos, sem características embriogênicas, a partir dos tegumentos dos óvulos. Esta observação foi confirmada através de análises histológicas. Visando determinar as condições ideais para o isolamento de protoplastos viáveis, a partir dos calos embriogênicos otimização. Este método foi bastante eficaz, tendo aumentado cerca de 15 vezes a produção de protoplastos viáveis. As melhores condições experimentais para o isolamento foram: digestão enzimática por 5 horas, em meio com as enzimas cellulase 307,6 mg/10 ml e macerozyme 30,3 mg/10 ml, e os estabilizadores osmóticos manitol 328,0 mM e sacarose 336,2 mM. A eficiência de isolamento (1,2 x 10 6 protoplastos viáveis/g) alcançada com as condições experimentais otimizadas, possibilita que os protoplastos venham a ser empregados em programas de melhoramento do cultivar Pera. Os protoplastos foram submetidos a várias doses de radiação gama 42 horas após o isolamento, para uma verificação da sensitividade dos mesmos, tendo sido o valor de LD 50 estimado em torno de 37,5 Gy.There are serious obstacles to the breeding programmes in citrus: prolonged juvenile period high heterozigosity, scarcity of information about the inheritance of many important characters, self-incompatibility, sterility, and nucellar embriony. A recent approach to the genetic improvement is based on tissue culture, including the use of protoplasts, "in vitro" mutagenesis and "in vitro" selection of desired characters. ln the present work, the factors involved in obtaining embryogenic callus in Citrus sinensis cv.Pera were studied. Ovules and nucelli extracted from fruitlets of different ages after anthesis were cultured on four different nutrient media including dark and light conditions. The explants developed embryoids and plantlets, which originated embryogenic callus from the hypocotyl region. Nucelli showed the highest percentages of embryogenic callus formation in all culture conditions tested. Emergence and proliferation of embryogenic callus occurred on nutrient media without hormones. The use of 2,4-D on nutrient media resulted in the inhibition of "in vitro" nucellar embryogenesis. There was non-embryogenic callus formation from the ovules integuments. This, observation was confirmed through histological analysis . Aiming to determine the ideal conditions to isolate viable protoplasts from embryogenic callus, the Simplex optimization method was used. This method was very efficient and increased the production of viable protoplasts about 15 times. The best experimental conditions for the isolation were: enzymatic digestion during 5 hours, on medium containing 307.6 mg/10 ml cellulase and 30.3 mg/10 ml macerozyme, and the osmotic stabilizers 328.0 mM mannitol and 336.2 mM sucrose. The isolation efficiency (1.2 x 106 viable protoplasts/g) reached with the optimized experimental conditions, enables protoplasts cultivar Pera. ln order to verify the radiosensitivity, protoplasts were submitted to several gamma radiation doses 42 hours after isolation and the LD50 value was estimated around 37.5 Gy