Plant regeneration and Gus transient expression in Stylosanthes guianensis (Aubl.) Sw. via Agrobacterium

Com o objetivo de estabelecer um protocolo de transformação de Stylosanthes guianensis via Agrobacterium foram estabelecidos primeiramente protocolos de cultura de tecidos para explantes derivados de hipocótilo superior, hipocótilo inferior, cotilédone, folíolos e raízes dos cultivares Mineirão e Bandeirantes. Houve pelo menos uma combinação dos reguladores de crescimento NAA (ácido alfa naftalenoacético) e BAP (6-benzilaminopurina) que propiciaram 100% de regeneração de brotos, exceto a partir de explantes cotiledonares de ambos os cultivares e raízes do cultivar Mineirão, onde observou-se regeneração da ordem de 67%. Os explantes mais eficientes foram hipocótilos superiores e inferiores do cultivar Mineirão, que deram origem, em média, a 20 e 16,7 brotos por explante, respectivamente. Os demais explantes apresentaram médias entre 2 a 10 brotos. As linhagens A208 e T37 de Agrobacterium tumefaciens e as linhagens 8196, A4 e A4T de A. rhizogenes causaram aparecimento de tumores em hipocótilos excisados de plântulas do cv. Bandeirantes germinadas in vitro. Os ferimentos causados pela inoculação levaram à formação de brotos nestes locais. A suscetibilidade ao Agrobacterium dos explantes com capacidade de formar brotos, na presença de ferimentos, pode consistir em um método alternativo para transformação de Stylosanthes, sem necessidade do uso de cultura de tecidos. Nos experimentos de transformação, foram utilizados os plasmídeos pEA24 e pEA ATS:2S, que contêm o gene da albumina 2S da castanha do Pará, rico em metionina, ligado ao gene uidA e ao marcador seletivo NPTII. A eficiência da transferência genética foi avaliada através de ensaio de GUS, 48 horas após o término do cocultivo, e demonstrou-se a eficiência do procedimento de inoculação utilizando-se explantes derivados de hipocóilos e raízes. Foram feitos dois experimentos de transformação com o cultivar Bandeirantes (303 explantes) e três com o cultivar Mineirão (753 explantes), inoculados, respectivamente, com as linhagens GV3101 (pEA24) e GV2260 (pEA24). O uso de controles permitiu concluir que a lavagem em tetraciclina não prejudicou a regeneração, e o cefotaxime teve efeito similar ao de uma auxina, aumentando a formação de calo e atrasando a formação de brotos. A kanamicina foi ineficaz como agente seletivo porque permitiu a formação de brotos não transformados e teve uma ação desuniforme, isto é, formaram-se brotos verdes não-transgênicos e brotos necróticos muito próximos, em um mesmo calo. Sugere-se então pela não utilização deste agente seletivo em experimentos de transformação com o cultivar Mineirão.Protocols for hypocotyl, cotyledon, leaflet and root derived tissue culture from cultivars Bandeirantes and Mineirão of Stylosanthes guianensis were established. There was at least one combination of the growth regulators NAA (naphthaleneacetic acid) and BAP (6-benzylaminopurine) that led to 100% of plant regeneration for all explants except cotyledon explants. In this case, around 67% of plant regeneration was achieved. Mineirão hypocotyl derived explants were the most efficient because they generated, for the superior and inferior hypocotyl halves, on average 20 and 16,7 shoot buds per explant, respectively. All other explants produced averages between 2 to 10 shoot buds. Tumors were incited on cv. Bandeirantes hypocotyl excised from in vitro germinated plantlets by the Agrobacterium tumefaciens A208 and T37 strains and the A. rhizogenes 8196, A4 e A4T strains. The inoculation led to shoot formation at the wound sites. Since shoot development and tumor occur at the same sites, it can be suggested that this procedure is an alternative for transforming Stylosanthes without using tissue culture. The plasmids pEA24 e pEA:ATS2S containing the metionine rich 2S albumin gene, the selectable marker nptll and the reporter uidA were used in transformation assays. The GUS histochemical assay 48 hours after cocultivation showed efficiency of the inoculation procedure utilizing hypocotyl and root derived explants. Two transformation experiments with Bandeirantes (303 explants) and two with Mineirão (753 explants) inoculated with MP90 (pEA24) and GV3101 (pEA24) respectively were carried out. The procedures used to kill the bacterias were evaluated by comparing treated groups with controls. It was concluded that washing the explants in a tetracycline solution had no effect in regeneration and that cefotaxime had an auxin like effect. Kanamicin was inefficient as a selective agent since it allowed untransformed shoot development and had an ambivalent effect because both non transgenic green shoots and necrotic shoots were formed very near in the same callus. So it can be suggested that this selective agent should not be used in S. guianensis cv. Mineirão transformation experiments