Analysis of prophage regions in different isolates of Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa é o agente causal da doença clorose variegada dos citros (CVC), e afeta principalmente a variedade de laranja doce no Brasil. É encontrada no xilema de plantas infectadas obstruindo o fluxo normal de água e nutrientes para todas as partes da planta. Os principais sintomas da doença são o aparecimento de frutos pequenos com a casca enrijecida e clorose nas folhas. Além de infectar variedades de laranjas, a bactéria é encontrada associada a doenças em outras culturas economicamente importantes como videiras, pessegueiros, ameixeiras, amoreiras, cafezais e carvalhos. O seqüenciamento completo do genoma revelou a presença de uma grande quantidade de regiões associadas a bacteriófagos. Duas dessas regiões foram ecolhidas para serem avaliadas em isolados de populações naturais infectando citros, uva e café através de PCR e seqüenciamento dos produtos amplificados. Os primers desenhados com base no genoma seqüenciado amplificam bandas de 1,0; 1,2; 1,4 e 1,7 kb. Os resultados mostraram que todos os isolados analisados apresentam seqüências semelhantes aquelas encontradas em bacteriófagos. Além disso, existe variação quanto ao número de produtos amplificados e seqüências de nucleotídeos dentro de isolados de citros de hospedeiros de diferentes regiões e entre os isolados de citros, café e videira. Dentro dos isolados de citros de hospedeiros de diferentes regiões do estado de São Paulo e Paraná dois grupos foram formados (grupo A e B), que compreendem os isolados de 9a5c(X0), Cordeirópolis, Itápolis, Araraquara (Rep3), Matão (Rep11), Matão (Rep16), Paraná (11067), Paraná (11399), Paraná (11834), Novais e Curupá, Itapetininga, Olímpia, Araraquara (Rep1), Matão (Rep15), Colina (11038), Colina (11039). Na seqüência amplificada de 1,2 kb aparecem 15 alterações de bases polimórficas, sendo que não ocorrem alterações na demarcação das ORFs nessa região e as proteínas traduzidas a partir dessa nova seqüência apresentam cerca de 92% de identidade. A seqüência amplificada de 1,4 kb entretanto, apresenta alterações significativas na composição de bases na região central do fragmento. Nessa região são encontradas seqüências cujo BLASTX encontra similaridade com ORFs localizadas em outras regiões de profago do genoma do clone de Xylella seqüenciado. Esses resultados indicam que existe variação significativa nas regiões associadas a bacteriófagos no genoma de isolados de diferentes hospedeiros de Xylella e que essas regiões devem estar associadas a rearranjos do genoma.Xylella fastidiosa is the causal agent of the disease named "variegated clorosis of citrus", which mainly affects sweet orange varieties of Brazil. It is found infecting the xylem of plants, obstructing water and nutrient fluxes throughout the plant. The major symptoms of the disease are small fruit size, hardened rind and leaf chlorosis. Besides infecting orange plants, the bacterium is found associated with diseases in other economically important crops, such as grapes, coffee, peaches, plum, oak. The fuIl sequencing of the genome of X fastidiosa disclosed the presence of many regions associated with bacteriophages. Two of these regions were chosen to be evaluated in isolates of natural populations infecting citrus, grape and coffee through PCR and sequencing of the amplified products. Use of primers designed from the genome sequence results in amplified bands of 1.0; 1.2; 1.4 and 1.7 kb. The resuIts show that alI the analyzed isolates present sequences similar to those found in bacteriophages. However, there is variation as to the number of amplified products and nucleotide sequences among the citrus isolates obtained from different regions and among the isolates from citrus, coffee and grapes. The citrus isolates from hosts from different regions of the state of São Paulo were distributed into two groups (group A e B): 9a5c(XO), Cordeirópolis, Itápolis, Araraquara(Rep3), Matão(Rep11), Cordeirópolis, Itápolis, Araraquara(Rep3), Matão(Rep 11), Matão(Rep 16) Paraná(11067), Paraná(11399), Paraná(11834), Novais and Curupá, Itapetininga, Olímpia, Araraquara(Rep1), Matão(Rep15), Colina(11038), Colina(11039). In the 1.2 Kb amplified sequence there are 15 polymorphic bases, but these differences do not change the boundaries of the ORFs in this region and the translated proteins from these new regions present an identity of 92%. However, the 1.4 kb amplified sequence presents significant alterations in the composition of bases in the central region of the fragment. In this region, sequences were found with a similarity (BLASTX) to ORFs located in other regions of the sequenced genome of Xylella. These results indicate that there are significant variations in regions associated with bacteriophages in the genome of isolates from different hosts of Xylella and that these regions may be associated with rearrangements of the genome