Evaluation of the impact of in vitro culture of isolated bovine preantral follicles on the quality of recovered oocytes

INTRODUÇÃO: Os programas de preservação de fertilidade baseados na criopreservação de gametas e tecido ovariano têm sido amplamente empregados para salvaguardar o potencial reprodutivo de mulheres em idade reprodutiva. Entretanto,o risco de reintrodução de células malignas após o reimplante do tecido e a dificuldade de aplicação dos protocolos de estimulação ovariana em pacientes estrogênio dependentes, dificultam o acesso destas pacientes aos programas de preservação de fertilidade já estabelecidos. O cultivo de folículos isolados vem se mostrando uma técnica promissora capaz de atender a essas pacientes, com resultados bastante satisfatórios. A recuperação de oócitos fertilizáveis tem se mostrado bem sucedida em camundongos resultando em nascidos vivos; já em outros mamíferos de grande porte,como primatas não humanos e humanos,há escassos relatos da obtenção de oócitos em estagio MII . OBJETIVO: Este estudo teve como objetivo analisar a eficiência do cultivo tridimensional in vitro no desenvolvimento de folículos ovarianos bovinos e a sua influência sobre o metabolismo oxidativo, a geração de estresse oxidativo celular e os níveis de transcritos de genes ligados atividade mitocondrial, apoptose e crescimento e desenvolvimento oocitário. MATERIAL E MÉTODOS: Foi realizado o cultivo in vitro tridimensional de folículos secundários bovinos por 16 dias em meio ?- MEM suplementado, em atmosfera de 5% de CO2 e 20% de O2 (Grupo in vitro - Gvt). Como controles foram incluídos dois grupos: um de folículos secundários isolados frescos não submetidos a cultivo (Grupo imaturos- GI) e outro de folículos extraídos já em estágios pré-antrais mais avançados do desenvolvimentos (Grupo in vivo- Gvv). Para a avaliação do desenvolvimento folicular, foram realizadas análises morfológica e testes de viabilidade, além da expressão por RT- qPCR de genes alvos para a atividade mitocondrial e estresse oxidativo. RESULTADOS: As análises do desenvolvimento dos folículos in vitro mostraram que 81,1% dos folículos secundários apresentaram crescimento, com uma taxa de viabilidade em torno de 84%. Cerca de 50% de oócitos recuperados após o cultivo estavam viáveis pela avaliação morfológica, embora nenhum deles tenha atingido o estágio final de maturação (MII). Além disso, o cultivo não promoveu aumento da expressão de genes ligados a apoptose o que também sugere uma boa viabilidade dos folículos cultivados. O mesmo não ocorreu com o sistema Kit Ligand e c-Kit, considerados como marcadores da capacidade global de crescimento e desenvolvimento folicular, verificou-se uma menor expressão de KL nas células somáticas da parede folicular. Com relação ao metabolismo oxidativo, embora o estado redox, marcado pela produção de NAD e FAD, estivesse bastante aumentado nos folículos produzidos in vitro quando comparado com o controle imaturo fresco e maturado in vivo, não se observou aumento das espécies reativas de oxigênio em oócitos obtidos destes mesmos folículos, podendo sugerir a manutenção da capacidade de controlar o balanço oxidativo por parte destas células. ,Também não houve alteração na expressão de genes ligados à biogênese mitocondrial entre os grupos estudos. CONCLUSÃO: O método de cultivo proposto neste estudo, utilizando o sistema 3D em matriz de gel de alginato, permitiu a maturação parcial de folículos secundários isolados, mantendo a viabilidade e características do metabolismo oxidativo semelhantes a folículos maturados in vivo de mesmo tamanho. Entretanto, há algum grau de comprometimento na saúde global do folículo, especialmente em relação às células somáticas da parede folicular.The fertility preservation programs based on oocyte and ovarian tissue cryopreservation has been widely employed to safeguard the reproductive potential of these patients. However, the risk of reintroducting malignant cells after ovarian tissue transplantation and the difficulty of applying ovarian stimulation protocols in patients with estrogen dependent diseases hinder the access of these patients to already established fertility preservation programs. Isolated follicle culture appears as a promising technique for these cases, with satisfactory results. The recovery of fertilizable oocytes has been shown to be successful in mice resulting in live births; in other large mammals, such as non-human primates and humans, there are a few reports of the obtention of oocytes in the MII stage. OBJECTIVE: This study aimed to analyze the efficiency of in vitro three-dimensional culture in the development of bovine ovarian follicles and their influence on oxidative metabolism, on cellular oxidative stress generation and on the transcript levels of genes linked to mitochondrial activity, apoptosis and oocyte growth and development. MATERIAL AND METHODS: Three-dimensional in vitro culture of bovine secondary follicles was carried out for 16 days in supplemented ?-MEM medium, in an atmosphere of 5% CO2 and 20% O2 (In vitro Group - Gvt). As controls, two groups were included: one of the fresh none cultured isolated secondary follicles (GI-immature group) and one of follicles isolated in a more advanced preantral stage (in vivo Group-Gvv). For the evaluation of the follicular development, morphological analysis and viability tests were performed, besides the expression by RT-qPCR of target gene for mitochondrial activity and oxidative stress were also evaluated. RESULTS: Analysis of the in vitro follicle development showed that 81.1% of the secondary follicles have grown, with a viability rate of 84%. About 50% of oocytes recovered after culture were viable by morphological evaluation, although none of them had reached the final maturation stage (MII). In addition, the culture did not promote increased on the expression of apoptosis-linked genes which also suggests good viability of the cultured follicles. The same was not observed with the Kit Ligand and c-Kit, considered as markers of the global capacity of follicular growth and development; there was a lower expression of KL in the somatic cells from the follicular wall. In relation to the oxidative metabolism, although the redox state, marked by the production of NAD and FAD, was greatly increased in follicles produced in vitro when compared to the immature controls and the in vivo matured group, there was no increase on the production of reactive oxygen species in the oocytes obtained from these follicles, suggesting that these cells were able to control their oxidative imbalance. Also, there was no alteration in the expression of genes linked to mitochondrial biogenesis between the studied groups. CONCLUSION: The culture method proposed in this study, using the 3D system in an alginate gel matrix, allowed the partial maturation of isolated secondary follicles, maintaining the viability and oxidative metabolism characteristics similar to follicles of the same size matured in vivo. However, there is some degree of impairment in overall health, especially in relation to the somatic cells from the follicular wall