Molecular structure of alpha-amylase isoinibitors from beans (Phaseolus vulgaris): a comparative

Foram purificados dois isoinibidores de α-amilase (IAs) do feijão preto, Phaseolus vulgaris, cv. Rico 23, através de extração aquosa, precipitação fracionada com sulfato de amônio, diálise contra água destilada e cromatografias em colunas de troca iônica, interação hidrofóbica e peneira molecular. Foram analisadas as caracteristicas químicas dos inibidores (I-1 e I-2), apresentando: 9,9 e 12,1% de carboidratos, 58 e 51 KDaltons de peso molecular, 4,70 e 4,65 como pontos isoelétricos e 13,4 e 36,7 de hidrofobicidade superficial, respectivamente. Também foram analisados o conteúdo de amino ácidos, os mapas trípticos, bem como as condições de dissociação molecular e mudanças conformacionais por agentes químicos e temperatura, avaliadas em SDS-PAGE, calorimetria diferencial e emissão de fluorescência. A separação das subunidades peptídicas foi realizada por cromatografia em DEAE-celulose-uréia 6M, procedendo-se o seqüenciamento parcial de 3 peptídeos isolados. A confrontação das seqüências obtidas com a seqüência da var. Greensleaves revelou homologias de até 59%. Porém, diferenças marcantes entre o I-1 e o I-2 demonstram que essas proteínas devem ser sintetizadas a partir de DNAs distintos. As proteínas isoladas são comprovadamente isoinibidores pertencentes a uma nova família de inibidores de α-amilase específica dos Phaseolus vulgaris.Two α-amylase isoinhibitors, I-1 and I-2, were purified from black beans Phaseolus vulgaris, cv. Rico 23. Both are glycoproteins acting on mammalian and insect α-amylases, having similar isoelectric points, 4.70 and 4.65, and aminoacid composition, but showing different molecular weights, 58 and 51 KDaltons, and surface hydrophobicity, 13.4 and 36.7, respectivily. Conformational changes due to dissociating agents and temperature were detected by SDS-PAGE, DSC and by following the fluorescence emission. The peptides dissociated by urea-SDS-β-mercaptoethanol were isolated on a urea-DEAE-celulose column. Three of the isolated peptides were sequenced showing up to 59% homology with the deduced sequence from the inhibitor of the var. Greensleaves. In spite of the similarity, they seem to be sythesizes by different DNAs