Cyanobacteria from coastal environment: phylogeny, gene and chemical prospecting of bioactive molecules

O filo Cyanobacteria constitui um grupo filogeneticamente coerente, embora, apresente grande diversidade morfológica, sendo sua sistemática constantemente revisada. Esses micro-organismos são, ainda, alvos de estudos biotecnológicos em razão da produção de toxinas e na busca por substâncias de interesse farmacológico. Dentre as linhagens analisadas neste estudo, sete sequências do gene rRNA 16S foram geradas e avaliadas com sequências previamente obtidas. Ao menos dois grupos podem representar novos gêneros de cianobactérias, sendo que um grupo demonstra ser endêmico de manguezais brasileiros. Os genes de inibidores de proteases, aeuruginosina, cianopeptolina e microviridina, foram detectados e a produção de aeruginosina foi confirmada por LC-MS nos gêneros Cyanobium e Nostoc. Sequências de aminoácidos do precursor de microviridina indicaram a produção de três novas variantes em quinze linhagens de cianobactérias dos gêneros Cyanobium, Synechococcus, Cyanobacterium, Nodosilinea e Nostoc. O potencial genético para produção de cilindrospermopsina (cyrJ) foi confirmado em vinte e seis linhagens. Em cinco linhagens dos gêneros Cyanobium e Nostoc foram encontrados os genes mcyD, mcyE e mcyG, envolvidos na biossíntese de microcistina. A sequência McyG da linhagem Nostoc sp. CENA175 agrupou-se filogeneticamente com outras de linhagens produtoras de microcistina. Os genes sxtA e sxtI, envolvidos na biossíntese de saxitoxina, foram encontrados em nove linhagens dos gêneros Cyanobium, Oxynema, Leptolyngbya, Nodosilinea e Nostoc. A sequência de SxtI da linhagen Leptolyngbya sp. CENA134 apresentou similaridade >= 70 % com proteínas hipotéticas enquanto as de Nostoc sp. CENA159 e Nostoc sp. CENA160 apresentaram similaridade >= 82 % com O-carbamoiltransferase. Na análise filogenética, a sequência de SxtI da linhagem Nostoc sp. 160 agrupou-se com sequências de linhagens produtoras de saxitoxina. Nas análises químicas, a fração 3 do extrato da linhagem Oxynema sp. CENA135 revelou uma substância com características de ácidos graxos poli-insaturados e a fração 2 do extrato da linhagem Nostoc sp. CENA175 apresentou uma estrutura aromática ligada a uma cadeia alifática. Outros três extratos, obtidos das linhagens Cyanobium sp. CENA157, Nodosilinea sp. CENA183 e Nostoc sp. CENA184 mostraram-se promissores quanto à presença de substâncias nitrogenadas. Os ensaios de bioatividade revelaram que 48 % dos extratos metanólicos inibiram o crescimento de ao menos um isolado de bactéria e/ou levedura. Os extratos das linhagens Cyanobium sp. CENA142 e Cyanobacterium sp. CENA169 foram eficientes contra o crescimento de seis bactérias patogênicas. Nos ensaios de inibição de células tumorais, o extrato de DCM da linhagem Cyanobium sp. CENA154 (100 ?gomL-1) inibiu moderadamente culturas de células 3LL. Os extratos etanólicos de Oxynema sp. CENA135 (20 ?gomL-1) e Cyanobium sp. CENA154 (100 ?gomL-1) inibiram as células CT-26. Em ensaios conduzidos com linhagens de células de glioma (U251), câncer de mama (MCF-7) e câncer de pulmão (NCI-H460), o extrato de DCM da linhagem Cyanobium sp. CENA136 inibiu 50 % do crescimento das respectivas células tumorais nas concentrações 7,8; 27,1 e 14,0 ?gomL-1. Desta forma, além de filogeneticamente diversas, as cianobactérias isoladas de ambiente marinho do Estado de São Paulo constituem fonte promissora de inibidores de proteases, cianotoxinas e substância bioativas com ação antibacteriana, antifúngica e antitumoral.The phylum Cyanobacteria is a phylogenetically coherent group, although presenting great diversity, and its systematic have been constantly reviewed. These microorganisms are also targets of biotechnological studies due to the production of toxins and the search for novel substances of pharmacological interest. Among the strains analyzed in this study, sequences of the 16S rRNA gene were generated for seven and, than, analyzed with sequences previously obtained. At least two groups may represent new cyanobacterial genera, while a group of Cyanobium proves to be endemic of Brazilian mangroves. Genes of the proteases inhibitors, aeuruginosin, cyanopeptolin and microviridin, were detected and the production of aeruginosin was confirmed by LC-MS for Nostoc and Cyanobium. The amino acid sequences of microviridin precursor indicated the production of three new variants in fifteen cyanobacterial strains of the genera Cyanobium, Synechococcus, Cyanobacterium, Nostoc and Nodosilinea. The genetic potential for production of cylindrospermopsin (cyrJ) was confirmed in twenty-six strains. In five strains of the genera Nostoc and Cyanobium the mcyD, mcyE and mcyG genes, which are involved in the microcystin biosynthesis, were found. The McyG sequence of Nostoc sp. CENA175 was phylogenetically grouped with sequences of microcystin-producing strains. The sxtA and sxtI genes, from saxitoxin biosynthesis, were found in nine strains of the genera Cyanobium, Oxynema, Leptolyngbya, Nodosilinea and Nostoc. The SxtI sequence of Leptolyngbya sp. CENA134 showed similarity >= 70 % with hypothetical proteins, while the sequences of Nostoc sp. CENA159 and Nostoc sp. CENA160 showed similarity >= 82% with O-carbamoyltransferase. In the phylogenetic analysis, the SxtI sequence of Nostoc sp. CENA160 grouped with sequences of strains that produce saxitoxin. In chemical analysis, the fraction 3 of the Oxynema sp. CENA135 extract revealed a substance with poly-unsaturated fatty acids characteristics and the fraction 2 of Nostoc sp. CENA175 extract indicated an aromatic structure, attached to an aliphatic chain. Other three extracts obtained from Cyanobium sp. CENA157, Nodosilinea sp. CENA183 and Nostoc sp. CENA184 were promising for the presence of nitrogenous substances. Bioactivity assays revealed that 48 % of the methanolic extracts inhibited the growth of at least one isolate of bacteria and/or yeast. The extracts of Cyanobium sp. CENA142 and Cyanobacterium sp. CENA169 were efficient against six pathogenic bacteria. In the inhibition assays of tumor cells, the DCM extract of Cyanobium sp. CENA154 (100 mgomL-1) moderately inhibited the growth of 3LL cells. Ethanol extracts of Oxynema sp. CENA135 (20 mgomL-1) and Cyanobium sp. CENA154 (100 mgomL-1) were able to inhibit cultures of CT- 26 cells. In tests conducted with glioma cell lines (U251), breast cancer (MCF-7) and lung cancer (NCI-H460), the DCM extract of Cyanobium sp. CENA136 caused 50 % of growth inhibition, respectively, when used at concentrations of 7.8, 27.1 and 14.0 mgomL-1. Thus, besides their phylogenetically diversity, the cyanobacteria strains from marine environment of the São Paulo state are a promising source of protease inhibitors, cyanotoxins and bioactive compounds with antibacterial, antifungal and antitumor activities