The role of IL-10 in murine pulmonary paracoccidioidomycosis.

O principal mecanismo de defesa de hospedeiros infectados pelo Paracoccidioides brasiliensis (Pb), fungo dimórfico que causa a mais importante micose sistêmica da América Latina, é a imunidade celular. Neste processo participam macrófagos ativados por IFN-g e a IL-10 parece ser a citocina que se contrapõe a esta ativação. Tanto na patologia humana como em modelos experimentais há fortes indicações de que a IL-10 age como supressora da imunidade celular causando efeitos deletérios aos hospedeiros; entretanto, estudos diretos sobre a função da IL-10 na paracoccidiodomicose (PCM) não tinham sido ainda realizados. Então o objetivo fundamental deste trabalho foi estudar a função da IL-10 nos mecanismos da imunidade inata e adaptativa contra o Pb utilizando como modelo experimental camundongos geneticamente deficientes de IL-10 (IL-10 nocaute, IL-10 KO) em comparação com seus controles normais (WT). Demonstramos in vitro que macrófagos peritoneais normais de camundongos IL-10 KO apresentam uma maior atividade fagocítica e fungicida que os macrófagos de camundongos WT e isto esteve associado à maior produção de IFN-g, TNF-&#945, óxido nítrico (NO) e da quimiocina MCP-1. Verificamos, entretanto, que a produção de IFN-g era realizada por células NKT contaminantes de macrófagos aderentes nos camundongos IL-10 KO, sugerindo uma possível participação destas células na ativação de macrófagos e de células T de camundongos IL-10 KO. Estudos in vivo revelaram que a partir da 2ª semana de infecção os camundongos IL-10 KO apresentaram uma resposta imune precoce em relação aos WT, pois os pulmões dos primeiros apresentavam carga fúngica significativamente menor, associada com aumento da maioria dos isótipos de anticorpos (IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b) específicos contra o fungo. Observamos também a inibição total da produção das citocinas IL-4 e IL-5, mostrando a ação reguladora da IL-10 na síntese de citocinas Th2. Na 4ª semana pós-infecção a carga fúngica continuou menor nos animais IL-10 KO, mas não foram observadas as diferenças quanto à síntese de anticorpos entre as duas linhagens. A análise dos leucócitos infiltrantes nos pulmões revelou um aumento na frequência de linfócitos T CD4+ ativados nos camundongos IL-10 KO em relação aos WT. A partir da 8ª semana, a carga fúngica pulmonar dos camundongos IL-10 KO reduziu consideravelmente e não ocorreu disseminação para outros órgãos. Observou-se também, nesta linhagem, um aumento na resposta de hipersensibilidade do tipo tardio (HTT), confirmando o padrão de resposta desviado para um perfil Th1. A análise histológica dos órgãos dos camundongos IL-10 KO revelou ausência de granulomas e fungos no pulmão em contraste aos seus controles WT que apresentavam elevado número de granulomas e fungos neste órgão. A análise dos linfócitos infiltrantes nos pulmões dos camundongos IL-10 KO mostrou redução na frequência de células B, o que é coerente com a baixa síntese de anticorpos observada. Houve aumento marcante na freqüência de células T CD4+ e T CD8+ memória/efetora, caracterizando mais uma vez a eficiente resposta imune celular nesses animais associada à ausência do papel regulador negativo da IL-10. Em fase mais tardia (16 semanas pós-infecção) a regressão da infecção nos camundongos IL-10 KO continuou evidente pelo pequeno número de fungos recuperados do pulmão, acompanhada de baixa síntese de citocinas (IL-5 e IL-2) e de anticorpos anti- P. brasiliensis. Na 23ª semana de infecção além da baixa carga fúngica nos camundongos IL-10 KO, associada à baixa frequência de células responsáveis pela imunidade celular ocorreu também redução na freqüência de células Treg, indicando o papel regulador da IL-10 nesta subpopulação celular. A elevada sobrevida (90%) dos animais IL-10 KO foi coerente com a baixa carga fúngica e eficiente resposta imune no curso da infecção. Em conjunto, nosso trabalho demonstra o importante papel regulador da IL-10 na imunidade da PCM.Cellular immunity is the main defense mechanism of hosts infected by the Paracoccidioide brasiliensis (Pb), a dimorphic fungus that causes the most important systemic mycosis in Latin America. IFN-g activated macrophages participate in this activity that is antagonized by IL-10 an anti-inflammatory cytokine. Both, in the human pathology and in experimental models, there are a number of evidences indicating that IL-10 acts as a suppressor of cellular immunity leading to deleterious effects to the hosts. However, direct studies aimed at investigating the function of IL-10 in the immunity to paracoccidioidomycosis (PCM) have not been performed. Thus, the fundamental objective of this work was to study the function of IL-10 in the mechanisms of innate and adaptive immunity against Pb using as experimental model IL-10 deficient mice (IL-10 Knockout, IL-10 KO) compared to their respective wild type (WT) controls. We demonstrated in vitro that normal peritoneal macrophages of IL-10 KO mice presented increased phagocytic and microbicidal activities than macrophages of WT mice and this was associated witch an elevated production of IFN-g, TNF-&#945, nitric oxide (NO) and the chemokine MCP-1. However, the production of IFN-g seen to be performed by NTK cells contaminating adherent macrophages, suggesting a possible participation of these cells in the activation of macrophages and T cells of IL-10 KO mice. In vivo studies revealed that at the second week of infection IL-10 KO mice presented an earlier immune response when compared to wild-type mice, since their lungs exhibited a significantly reduced fungal burden and an increased production of almost all antibodies isotypes (IgM, IgG1, IgGM, IgG2b). This effect was accompanied by a total absence of IL-4 and IL-5, showing a regulatory action of IL-10 in the synthesis of Th2 cytokines. Four weeks post-infection, the fungal load was still lower in the IL-10 KO mice but no differences in antibody synthesis was observed. However, the analysis of lung infiltrating leukocytes revealed an increased frequency of TCD4+ and TCD4+CD44 high lymphocytes in IL-10 KO mice, again demonstrating an early activation of cellular immunity in IL-10 KO mice. When compared with WT mice, the pulmonary fungal loads of IL-10 KO mice at week 8 of infection were drastically reduced and no dissemination to other organs were observed. The histopathological analysis revealed an absence of granulomas and fungi in the lungs of IL-10 KO in comparison with WT mice. The analysis of lung infiltrating leukocytes showed that IL-10 KO mice had a reduction in the frequency of B cells, in agreement with the reduced synthesis of immunoglobulins. An increased frequency of activated T CD4+ and a drastic increase of TCD4+ and T CD8+ effector/memory cells charactering once again an efficient immune response associated with IL-10 deficiency. In later stages, sixteen weeks after infection, a regressive infection of IL-10 KO mice was further characterized by low numbers of fungi in the lung, reduced synthesis of cytokines (IL-4 and IL-5) and anti- P. brasiliensis antibodies. By week 23 after infection, in addition to the characteristic reduction of fungal loads and reduced frequency of immune cells, we observed a decrease in the frequency of Treg cells, demonstrating the implication of IL-10 in the control of this T cell population. The elevated survival (90%) of IL-10 KO mice was in total agreement with the low fungal burdens and efficient immune response observed during infection. In conclusion, our work demonstrates for the first time that IL-10 plays a major role in the control of innate and adaptive immunity to Pb infection