Effect of vascular endothelial growth factor receptors inhibition on tumor angiogenesis in head and neck squamous cell carcinoma

O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) tem sido considerado o principal indutor da angiogênese tumoral por sua ligação a receptores específicos tirosina-quinase presentes nas células endoteliais (VEGFR). Uma importante via reguladora da angiogênese é caracterizada pela ligação do VEGF ao seu receptor VEGFR-2 ativando a via de sinalização de PI3-K, que estimula a expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 elevando a expressão de citocinas pró-angiogênicas CXCL-8 e CXCL-1, o que resulta na proliferação de células endoteliais. Recentemente, foi descoberta uma droga com ação antiangiogênica denominada de PTK787/ZK 222584 (PTK/ZK), que se mostrou um potente inibidor do receptor tirosina-quinase de VEGF, sem aparente efeito citotóxico em células que não expressam esses receptores. Visando a melhor compreensão do mecanismo de ação e da via de atuação antiangiogênica VEGF/VEGFR do PTK/ZK nos carcinomas espinocelulares de cabeça e pescoço, foram desenvolvidos estudos in vitro e in vivo avaliando-se a expressão de Bcl-2, CXCL-8 e CXCL-1. No presente estudo foi utilizado um modelo experimental de angiogênese humana em camundongos imunodeprimidos que receberam co-implantes de células tumorais e endoteliais ou apenas células endoteliais, tratados com administração oral de PTK/ZK por 21 dias. A progressão tumoral nos animais foi avaliada por meio de imagem de bioluminescência. Após o sacrifício dos camundongos, os implantes foram incluídos em parafina sendo obtidos cortes de 3µm para análise da densidade vascular e de 7µm para a técnica de microdissecção a laser visando a avaliação de RNA por meio de RT-PCR e PCR em tempo real nas células malignas e endoteliais. Concomitantemente, experimentos in vitro de co-cultura de células tumorais e endoteliais foram realizados para a análise de expressão de Bcl-2, CXCL-8 e CXCL-1 avaliados por meio de RT-PCR, Western Blot e teste ELISA. Os resultados demonstraram uma redução importante da expressão de Bcl-2, bem como de CXCL-8, em células endoteliais in vitro e in vivo quando tratados com PTK/ZK. Além disso, houve uma redução significativa na densidade vascular nos implantes dos animais tratados com o medicamento. Estes resultados reforçam a ação antiangiogênica do PTK/ZK nas células endoteliais sugerindo uma provável via de sinalização na qual a redução da expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 causou uma diminuição da expressão da molécula pró-angiogênica CXCL-8, o que resultou numa menor densidade vascular e, conseqüentemente, menor crescimento tumoral. Conclui-se, portanto, que o PTK/ZK mostrou ser um medicamento antiangiogênico eficaz que poderá, no futuro, ser utilizado como terapêutica adjuvante nos pacientes portadores de carcinomas espinocelulares de cabeça e pescoçoThe Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) has been considered the most important mediator in inducing tumor angiogenesis. It binds to specfic receptors known as Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR). An important pathway for angiogenesis is VEGF binding to VEGFR-2 and through PI3-K stimulates expression of antiapoptotic protein Bcl-2, inducing expression of proangiogenic cytokines CXCL-8 and CXCL-1, resulting in endothelial cell proliferation. A recently developed antiangiogenic drug is PTK787/ZK 222584 (PTK/ZK), a potent tyrosine kinase VEGFR inhibitor, without aparent cytotoxic effect on cells without expression of these receptors. For the better understanding of this mechanism and the angiogenic VEGF/VEGFR pathway of PTK/ZK in head and neck squamous cell carcinoma, it was developed in vitro and in vivo studies evaluating Bcl-2, CXCL-8 and CXCL-1 expression. A human angiogenesis experimental model was used in immunodeficient mice that received implants of tumor and endothelial cells or endothelial cells only, treated with PTK/ZK orally administered during 21 days. Tumor progression was evaluated by bioluminescence imaging. After mice sacrifice, the implants were paraffin embedded and 3µm sections were obtained for microvessel density analisis and 7µm sections for tumor and endothelial cells RNA retrieving by laser microdissection and analyzed by RT-PCR and Real time PCR. In vitro studies with co-culture of tumor and endothelial cells were analyzed by RT-PCR, Western Blot and ELISA to evaluate Bcl-2, CXCL-8 and CXCL-1 expression. The in vitro and in vivo results showed important downregulation of Bcl-2 as well as CXCL-8 expression in endothelial cells when treated with PTK/ZK. In addition, it was observed a significant reduction of microvessel density in implants of animals treated with the drug. These results suggest that the antiangiogenic mechanism of PTK/ZK on endothelial cells seems to occur by downregulation of antiapoptotic Bcl-2 expression leading to downregulation of pro-angiogenic CXCL-8, resulting in less tumor growth. In conclusion, PTK/ZK seems to be an efficient antiangiogenic drug for future adjuvant therapy of patients with head and neck squamous cell carcinoma