Obtention and characterization of undifferentiated stem cell of embryonated eggs from Caligo illioneus illioneus (CRAMER, 1776) (Lepidoptera, Morphidae: Brassolini) as cellular model of Lepidoptera

A subespécie Caligo illioneus illioneus, conhecida popularmente por Olho-de-coruja é uma Lepdóptera importante da Mata Atlântica no Brasil, possuindo ampla distribuição Neotropical, sendo predadora voraz de diversas culturas agrícolas de importância econômica quando em seus estádios de lagarta. Desde o descobrimento da primeira estabilização por Grace (1962), mais de 500 linhagens celulares de insetos já foram estabelecidas, sendo ferramentas valiosas para o progresso nos estudos fisiológicos, propagação in vitro de patógenos, pesquisas sobre controle de pragas e na produção de proteínas recombinantes. Porém, poucos trabalhos apresentaram resultados positivos com linhagens de células tronco embrionárias, especialmente em Lepidópteras. Este projeto teve como objetivo obter, isolar e caracterizar células tronco indiferenciadas de ovos embrionados de Caligo illioneus illioneusobtidas a partir de culturas primárias sob protocolo de cultivo celular específico para Lepidópteras, armazenamento em nitrogênio líquido, avaliação da manutenção e expansão in vitro. Através de análises anatômicas e taxonômicas, confirmou-se que a subespécie tratava-se de Caligo illioneus illioneus. As análises ultraestruturais do cório do ovo, através de microscopia eletrônica de varredura, demonstraram variação de 32-35 carenas verticais, havendo diferenças taxonômicas no cório do ovo das espécies do gênero Caligo. Após a obtenção das células do embrião, estas foram isoladas e cultivadas em meio de cultura celular DMEM-High suplementado, em temperatura de 22°C sem a adição de CO2. Foram realizadas as análises de aspectos citológicos, morfologia celular, ciclo celular, análises de imunofenotipagem por citometria de fluxo e potencial elétrico e funcional da membrana mitocondrial. As células apresentaram formato globóide, sem adesão ao substrato, com o núcleo bem delimitado e com baixo volume celular. Os dados obtidos pelas análises do ciclo celular das 4 amostras em diferentes passagens demonstraram que o protocolo estabelecido para a cultura celular foi favorável, com significativo rendimento no número de células, na expansão e criopreservação, confirmado pelo aumento na proporção de células nas fases G2/M e de Síntese, e que as células estavam realizando os processos naturais de interfase e de divisão celular responsável pela embriogênese e crescimento. A análise de imunofenotipagem por citometria de fluxo apresentou marcações positivas com alta expressão para os marcadores de células pluripotentes (Sox2 e Oct 3/4), marcadores de morte celular por apoptose (Caspase 3 e HSP70), marcadores específicos de insetos (Anti Rab-5, Axons BP 102, GM 130 e Dro. FMR1) e marcadores de células de origem mesenquimal (Stro-1, Vimentina), apresentando baixa expressão somente em CD 90. O experimento de potencial elétrico e funcional da membrana mitocondrial apresentou células metabolicamente ativas, não evidenciando diferenças significativas entre as culturas primárias e entre terceira e quinta passagens das 4 amostras. Concluiu-se que foi possível estabelecer um protocolo de cultura celular para Lepidópteras livre de patógenos e que os ovos embrionados de Caligo illioneus illioneus com 3 e 4 dias para a eclosão apresentaram maior duração em cultura celular, possuindo células indiferenciadas, representando, deste modo, uma ferramenta promissora com grande potencial para pesquisas em biotecnologia e biologia molecular, principalmente devido ao fato da espécie ser de importância ecológica, médica e em controle de pragas nas ciências agráriasCaligo illioneus illioneus subspecies, known popularly by Owl Butterfly, is an important Lepdoptera of the Brazilian Atlantic Forest, with wide distribution Neotropical, being a voracious predator of various agricultural crops of economic importance when in their caterpillar stages. Since discovery of the first stabilization by Grace (1962), over 500 insect cell lines have been established and are valuable tools for progress in physiological studies, in vitro propagation of pathogens, research on pest control and the production of recombinant proteins. However, few studies showed positive results to embryonic stem cell lines, especially in Lepidoptera. This study aimed to obtain, isolate and characterize undifferentiated stem cells of embryonated eggs from Caligo illioneus illioneus, obtained from primary cultures under specific cell culture protocol to Lepidoptera, storage in liquid nitrogen, evaluation of maintenance and expansion in vitro. By means of anatomical and taxonomic analysis, it was confirmed that the subspecies was Caligo illioneus illioneus. Ultrastructural analysis of the egg chorion, by scanning electron microscopy showed variation of 32-35 vertical carina, having taxonomic differences in egg chorion at the Caligo species. After obtaining the embryonic cells, these were isolated and cultured in cell culture medium DMEM-High supplemented, at 22 ° C without addition of CO2. They were carried out analysis of cytological aspects, cell morphology, cell cycle, immunophenotyping by flow cytometry and electrical and functional potential of mitochondrial membrane. The cells showed globoid shape without adhesion to the substrate, with well-defined nucleus and low cell volume. Data obtained by cell cycle analysis of the four samples at different passages showed that established protocol for cell culture was favorable, with significant yield relative to the number of cells, the expansion and cryopreservation, confirmed by the increase in the proportion of cells in G2/M and Synthesis phases, and the cells were performing the natural processes of interphase and cell division, responsible for embryogenesis and growth. Immunophenotyping analysis by flow cytometry showed positive markings with high expression for pluripotent cells markers (Sox2 e Oct 3/4), markers of cell death by apoptosis (Caspase 3 e HSP70), specific markers for insects (Anti Rab-5, Axons BP 102, GM 130 e Dro. FMR1) and mesenchymal cell markers (Stro-1, Vimentina), presenting low expression only in CD 90. The electrical and functional potential analysis of mitochondrial membrane has resulted in metabolically active cells, not evidencing significant differences among primary cultures and between the third and fifth passages of 4 samples. It was concluded that it was possible to establish a cell culture protocol to Lepidoptera free from pathogens and that embryonated eggs from Caligo illioneus illioneus with 3 to 4 days for hatching showed longer duration in cell culture, having undifferentiated cells, representing in this way, a promising tool with great potential for research in biotechnology and molecular biology, mainly due to this species have ecological and medical importance and in control pests at the agricultural science