Screening of species from the genus Penicillium producing mycelium bound lipases to be applied in the hydrolysis of vegetable oils

O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial de diferentes espécies de fungos filamentosos do gênero Penicillium, possuindo elevada expressão de atividade lipolítica (glicerol éster hidrolase - EC 3.1.1.3), para utilização na hidrólise de óleos vegetais. Na primeira etapa foi avaliado o crescimento de dez espécies isoladas de diferentes habitats empregando meio de cultura líquido sintético, contendo azeite de oliva como principal fonte de carbono. Os parâmetros de resposta adotados foram: crescimento de biomassa celular e atividade hidrolítica no micélio e no filtrado (extracelular) e por meio destes ensaios foi possível selecionar três espécies produtoras de lipase retida no micélio com elevada atividade (> 150 U/g), P. italicum AT4421, P. janthinellum CCT3162 e P. purpurogenum AT2008. A atividade ligada ao micélio mais elevada foi obtida para P. italicum (199,3±9,5 U/g) o qual também apresentou a menor atividade no filtrado, resultando em uma relação entre as atividades ligadas ao micélio e extracelular da ordem de 10 vezes. As lipases das outras duas espécies também apresentaram baixas atividades no filtrado, correspondendo a proporções de atividades micélio/extracelular entre 9 a 7, a saber: P. purpurogenum (8,7), P. janthinellum (7,8). A determinação das propriedades bioquímicas e cinéticas das lipases dos fungos selecionados revelou valores similares de atividades máximas, abrangendo a faixa de temperatura e pH de 35-45 °C e 7-7,5, respectivamente. Os valores de Km variaram de 123,6 a 151,3 mM e os valores de Vmax entre 387,6 e 539,1 ?mol/min. Quanto à estabilidade térmica verificou-se que lipase de P. janthinellum foi a menos estável a 50 °C (t1/2 = 0,92 h) e a P. purpurogenum a mais estável (t1/2 = 1,21 h). Testes de hidrólise de óleos vegetais com diferentes composições em ácidos graxos foram efetuados para determinar a especificidade de cada lipase por ácido graxo. Para a lipase da espécie P. purpurogenum a maior porcentagem de hidrólise foi obtida quando utilizado óleo de coco, resultando em 60,6±0,6% em ácidos graxos livres. Ambas as lipases de P. italicum e P. janthinellum, revelaram elevada especificidade para óleos vegetais contendo ácido oleico como componente majoritário, como o óleo de canola, resultando em graus de hidrólise de 77,1±1,9% e 60,3±1,9% respectivamente. Para todas as lipases testadas, a concentração adequada do substrato foi estabelecida em 25% m/m (3:1 razão água/óleo) e a utilização de ondas ultrassonoras forneceu incrementos de pelo menos 1,2 vezes no grau de hidrólise em curto período de tempo (5 a 8 h). A composição dos hidrolisados por cromatografia gasosa indicam que as lipases das três espécies selecionadas foram capazes de enriquecer o meio com ácidos graxos obedecendo a composição de suas respectivas matérias-primas lipídicas. Para as lipases de P. italicum e P. janthinellum utilizando o óleo de canola, os ácidos graxos liberados foram basicamente insaturados, sendo que aproximadamente 50% desse material foi composto por ácido oleico (C18:1). Para a lipase de P. purpurogenum utilizando o óleo de coco, a composição de seu hidrolisado foi aproximadamente 50% de ácido láurico (C12:0). Potenciais aplicações deste procedimento são as reações de hidrólises de óleos vegetais para obtenção de concentrados de ácidos graxos de alto valor agregado (ômega 6), pré-tratamento de efluentes da indústria alimentícia e uma excelente alternativa na utilização em reações de hidroesterificação para produção de biocombustíveis utilizando matérias-primas de baixa qualidade.The aim of this study was to evaluate the potential of different species from filamentous fungi the genus Penicillium, with high expression in lipolytic activity (glycerol ester hidrolase EC 3.1.1.3), for using in the hydrolysis of vegetable oils. Ten species of Penicillium genus, isolated from different habitats, were growth in synthetic liquid medium containing olive oil as main carbon source, and the selection was based on the following parameters: biomass growth and hydrolytic activities attained in the mycelium bound and filtrate (extracellular). Under these conditions, three lipases producing species (P. italicum AT4421, P. janthinellum CCT3162 and P. purpurogenum AT2008) were selected by retaining high activity in the mycelium (> 150 U/g) and lower activity in the filtrate. P. italicum was found to have the highest lipase mycelium-bound activity (199.3±9.5 U/g) lower filtrate activity (mycelium-bound and extracellular activity ratio of 10-fold). The other species also showed low filtrate lipolytic with mycelium-bound and extracellular activity ratios of 8.7 and 7.8-fold for P. purpurogenum and P. janthinellum, respectively. The determination of biochemical and kinetic properties of the lipases resulted in similar maximum activities at pH and temperature range of 35-45ºC and 7-7.5, respectively. Values for Km varied from 123.6 to 151.3 mM and Vmax values between 387.6 and 539.1 ?mol/min. The thermal stability assays showed that lipase of P. janthinellum was less stable at 50 °C (t1/2=0.92h) and P. purpurogenum was the most stable (t1/2=1.21h). The selected mycelium-bound lipases were assayed in the hydrolyis of vegetable oils having different fatty acids composition. This allowed determining for each lipase its selectivity for fatty acids. According to the results, P.purpurogenum lipase was found to have the highest hydrolysis percentage with saturated vegetable oils, such as coconut oil attaining 60.6±0.6% of free fatty acids. Both P. italicum and P. janthinellum lipases showed high selectivity for vegetable oil rich in oleic acid, such as canola oil, resulting in hydrolysis degrees of 77.1 ± 1.9% and 60.3±1.9%, respectively. For all tested lipases suitable substrate concentration was established at 25% w/w (3:1 water/oil ratio) and the use of ultrasound irradiations provided increments in the degree of hydrolysis of at least 1.2 fold in short period of time (5 to 8 h). The hydrolysate composition determined by gas chromatography indicated that all the three selected lipases were able to enrich the medium with fatty acids according to their respective lipid raw materials. For the lipase from P. italicum and P. janthinellum using canola oil, the fatty acids released were basically unsaturated, and approximately 50% of this material was composed of oleic acid (C18:1). For the lipase from P. purpurogenum using coconut oil, its composition was approximately 50% hydrolysate of lauric acid (C12:0). Potential applications of this procedure are the hydrolysis of vegetable oils for obtaining high valuable fatty acids (omega 6), pretreatment of wastewater from food industries and an excellent alternative in hidroesterification reactions to biofuel production using low-quality raw materials