Polymorphism in Adenosine Receptors and their Associations with Different Pathophysiological Characteristics and Evaluation of Components in the Biosynthesis of Adenosine in Patients with Sickle Cell Disease.

Na Anemia Falciforme em situações de baixa tensão de oxigênio, a hemoglobina mutante S (HbS) sofre polimerização promovendo a falcização das hemácias, que podem aderir ao endotélio vascular, causando a oclusão de vasos (VO) e isquemia tecidual (crises dolorosas) que caracterizam o quadro clínico da doença. Além disso, os pacientes falciformes apresentam outras manifestações clínicas como o priapismo, alterações ósseas, certas complicações pulmonares entre outros. Além das células eritróides, células endoteliais, leucócitos e plaquetas também desempenham um papel fundamental na fisiopatologia da anemia falciforme. A hidroxiuréia (HU), na anemia falciforme, aumenta a produção de hemoglobina fetal (HbF) em células eritróides, reduzindo a polimerização da HbS, diminuindo os sintomas clínicos dos pacientes. O aumento da HbF, no entanto, não implica necessariamente na melhora clínica, indicando desta forma a potencial ação da HU sobre outros processos. Estudos recentes vêm relacionando priapismo e asma com elevados níveis de adenosina. Devido a esta importância da adenosina relacionada a patologias comuns a AF, tivemos como objetivo identificar polimorfismos em genes de receptores de adenosina e na adenosina deaminase e verificar a possível associação entre as manifestações clínicas, além de investigar o papel da HU na modulação de marcadores envolvido na síntese e degradação da adenosina. Foram analisados diversos sítios polimórficos nos genes que codificam ADORA1, ADORA 2b, ADORA 3 e ADA, seguindo com a genotipagem em pacientes com AF, comparando afetados e não afetados. Em adição foi avaliada a expressão diferencial de mRNA de ADA pela HU em monócitos destes pacientes, comparando tratados e não tratados e também avaliamos por citometria de fluxo a modulação de marcadores de superfície CD39, CD73 e CD26, pela HU. As análises estatísticas foram realizadas utilizando os softwares GenePop 3.4 para análises de associação, cálculo do HWE, GraphPad Prism 5, Arlequin para identificação de desequilíbrio de ligação, haplótipos, heterozigozidade e SAS 9.13 para associação dos haplótipos as características. Os resultados mostraram que os pacientes sob tratamento com HU apresentaram um aumento da expressão de mRNA de ADA, aumento da expressão de CD26 em monócitos e diminuição de CD39 em linfócitos. Sem alterações significativas em relação a CD73. Encontramos também um aumento da freqüência do alelo T do SNP (rs1685103) presente no gene de ADORA 1 associado com pacientes afetados com síndrome torácica aguda. Apesar de não ter sido estatisticamente significante, concorda com dados da literatura. No gene ADORA 2B, verificamos associação do SNP 1007 C>T no desenvolvimento de STA indicando o alelo T como fator de risco e o alelo C para alterações ósseas. Para o SNP 968 G>T houve associação com alterações ósseas. Na análise haplotípica entre os SNPs 968 G>T e 1007 C>T encontramos associação dos haplótipos ht2 e ht3 com STA, como fator de risco, ht2 para hipertensão pulmonar. ht1 para priapismo, alterações ósseas e estenose/AVC. Os haplótipos formados pelos três SNPs 968 G>T, 1007 C>T e rs16851030, encontramos associação entre ht1, ht3 e ht4 entre os afetados com priapismo, caracterizando-o como haplótipo de risco e também ht1 e ht6 associados à estenose/AVC. Concluímos, que a hidroxiuréia participa na modulação da expressão da adenosina deaminase, de CD26 em monócitos e CD39 em linfócitos. Além disso, mostrou-se a importância de sítios polimórfico presente no gene ADORA 2B e ADORA1 envolvido na fisiopatologia das manifestações clínicas da doença falciforme. Associações dos SNPs em ADORA 1 e ADA, devem ser melhor estudados em um número maior de pacientes. A determinação destes polimorfismos associados com diferentes características clínicas pode levar a um melhor entendimento dos processos fisiopatológicos da anemia falciforme, levando à identificação de pacientes de risco, possibilitando um manejamento racional dos mesmos, em termos de cuidados específicos, ou mesmo à determinação de alvos para o desenvolvimento de terapias alternativas.In sickle cell disease in low oxygen tension, mutant hemoglobin S (HbS) undergoes polymerization promoting sickling of red blood cells that can adhere to vascular endothelium, causing vessel occlusion (VO) and tissue ischemia (painful crises) that characterize the clinical disease. In addition, sickle cell patients have other clinical manifestations such as priapism, bone disorders, certain pulmonary complications among others. In addition to the erythroid cells, endothelial cells, white cells and platelets also play a key role in the pathophysiology of sickle cell anemia. Hydroxyurea (HU) in sickle cell anemia, increases the production of fetal hemoglobin (HbF) in erythroid cells, reducing the HbS polymerization, reducing the clinical symptoms of patients. The increase in HbF, however, does not necessarily imply clinical improvement, thus indicating the potential effects of HU on other processes. Recent studies relating asthma and priapism with high levels of adenosine. Due to this importance of adenosine-related pathologies common to AF, we aimed to identify gene polymorphisms in adenosine receptors and adenosine deaminase and verify the possible association between clinical manifestations, and to investigate the role of HU in the modulation of markers involved synthesis and degradation of adenosine. We analyzed several polymorphic sites in genes that encode ADORA1, ADORA 2b, 3 and ADORA ADA, according to the genotype in patients with AF, comparing affected and unaffected. In addition we assessed the differential expression of ADA mRNA by HU in monocytes of these patients, comparing treated and untreated, and also evaluated by flow cytometry modulation of surface markers CD39, CD73 and CD26 by HU. Statistical analysis was performed using the software GenePop 3.4 for association analysis, calculation of HWE, GraphPad Prism 5, Arlequin for identification of linkage disequilibrium, haplotypes, heterozygosity and SAS 9.13 for association of haplotypes features. The results showed that patients treated with HU showed an increase in mRNA expression of ADA, increased expression of CD26 on monocytes and decreased CD39 on lymphocytes. No significant changes in relation to CD73. We also found an increased frequency of allele T (SNP rs1685103) present in a gene associated with ADORA affected patients with acute chest syndrome. Although not statistically significant, agrees with literature data. ADORA 2B gene, we found association of the SNP 1007 C> T in the development of STA indicating the T allele as a risk factor for the C allele and bone changes. For the SNP 968 G> T was associated with bone disorders. In haplotype analysis between SNPs 968 G> T and 1007 C> T found association of haplotypes ht2 and HT3 with STA as a risk factor for pulmonary hypertension ht2. ht1 for priapism, stenosis and bone disorders / stroke. The three haplotypes formed by SNPs 968 G> T, 1007 C> T and rs16851030, we found association between ht1, HT3 and HT4 among those affected with priapism, characterizing it as a risk haplotype and also ht1 ht6 associated with renal and / AVC. We conclude that hydroxyurea participates in modulating the expression of adenosine deaminase of CD26 on monocytes and CD39 on lymphocytes. Moreover, he showed the importance of polymorphic sites in this gene and ADORA 2B ADORA1 involved in the pathophysiology of clinical manifestations of sickle cell disease. Associations of SNPs in ADORA 1 and ADA should be better studied in a larger number of patients. The determination of these polymorphisms associated with different clinical characteristics can lead to a better understanding of the pathophysiological processes of sickle cell anemia, leading to the identification of patients at risk, enabling a rational handling of the same in terms of specific care, or even the determination of targets for the development of alternative therapies