Validation of differentially expressed genes identified in MCF-7 cells with differences in expression of PAR-4 (Prostate Apoptosis-Response 4) before and after exposure of docetaxel

O PAWR (Prostate apoptosis response- 4) também conhecido como PAR-4 é um gene pró-apoptótico identificado em células de câncer de próstata quando expostas a estímulos apoptóticos. A expressão de PAR-4 pode aumentar a sensibilidade da célula a apoptose, incluindo células de câncer de mama. Ensaios de expressão gênica por transcriptoma foram realizados em nosso laboratório (dados ainda não publicados), com o objetivo de analisar genes diferencialmente expressos associados à quimiossensibilidade ao docetaxel em células MCF-7 transfectadas com o vetor de expressão para PAR-4 (MCF7pcPAR4) e o com vetor vazio (MCF7pcNEO) antes e após o tratamento com docetaxel. Para avaliar a interação entre os genes diferencialmente expressos foram geradas redes gênicas funcionais utilizando o programa IPA- Ingenuity®. Dentre as diversas redes gênicas geradas destacaram-se as que continham genes relacionados direta ou indiretamente com a via de sinalização WNT (Wingless-Type MMTV Integration 1). O presente estudo visa validar genes diferencialmente expressos identificados em células MCF-7 com diferenças de expressão de PAR-4 antes e após a exposição de docetaxel. Através da anotação manual dos genes mais diferencialmente expressos, foram selecionados os genes EGR1, XAF1, TARP e WNT5A para validação por PCR em Tempo Real (qRT-PCR). A plataforma Human WNT Signaling Pathway RT2 Profiler(TM) PCR Array (PCR Array) foi utilizada para avaliar o efeito da overexpressão de PAR-4 e do tratamento de docetaxel na expressão de genes das vias canônica e não canônica do WNT. A expressão positiva do gene WNT5A nas células MCF7pcPAR4 em relação a MCF7pcNEO foi confirmada por qRT-PCR na ausença e presença do tratamento com docetaxel. O gene EGR1 apresentou regulação positiva significativa na técnica de qRT-PCR na ausência de tratamento, porém não apresenta o mesmo perfil de expressão observado no ensaio de transcriptoma. O gene XAF1 apresentou regulação negativa nas células MCF7pcPAR4 quando comparadas com as células MCF7pcNEO na ausência e presença de docetaxel, com tendência a validação na ausência de tratamento e de não validação na presença de docetaxel. Foi observado o aumento significativo da expressão de TARP nas células MCF7pcPAR4 por qRT-PCR na ausência e presença de docetaxel, porém esses achados não confirmam os resultados obtidos no transcriptoma. Em nossos dados de PCR Array na comparação MCF7pcPAR4 vs MCF7pcNEO antes do tratamento, encontramos diferença de expressão significativa (p < 0,005) em 9 genes. Sendo que, os genes CDKN2A, EGR1, FGF7, IL6 e TWIST apresentaram expressão positiva e os genes NTRK2, SOX2, SOX9 e WISP1 tiveram expressão negativa. Na comparação na presença de docetaxel observamos que os genes CACNAD2A3, GDF5, IL6, FGF7, LEF1 e TWIST apresentaram regulação positiva e FST apresentou regulação negativa com significância estatística (p < 0,005). Dos 84 genes da plataforma PCR array foram observados 21 e 14 genes comuns entre ambas às técnicas na ausência e presença de docetaxel, respectivamente. Na ausência de docetaxel 16 genes apresentaram o mesmo perfil de expressão, dentre estes a regulação positiva de GJA1, IGF1, IGF2, LEF1, MMP2, PDGFRA, PTGS2 e TWIST, associadas á regulação negativa de CDH1, JAG1, NTRK2 sugerem ativação da via WNT/?-catenina. Enquanto, a expressão de DAB2, WNT5A, FZD7 e RUNX2 indica inativação dessa via. Na presença do tratamento 6 genes apresentaram o mesmo perfil de expressão. Dentre estes, a regulação positiva de CTGF, DAB2 e EGR1 sugerem inativação da via WNT/beta-catenina. Por outro lado, a expressão positiva de FGF20, LEF1 e PDGFRA sugerem que via WNT/beta-catenina estaria ativa. Neste estudo, podemos mostrar que PAR-4 modula genes da via de sinalização WNT. Porém, mais experimentos serão necessários para verificar quais mecanismos estão envolvidos e de que forma isso reflete na quimiossensibilidade a drogasPAWR (Prostate Apoptosis Response-4) also known as PAR-4 is a pro-apoptotic gene identified in prostate cancer cells when exposed to apoptotic stimuli. PAR-4 expression can increase sensitivity of cells to apoptosis, including breast cancer cells. Our laboratory performed transcriptome profiling (unpublished data), with the aim of analyzing differentially expressed genes associated with chemosensitivity to docetaxel in transfected MCF-7 cells with PAR-4 expression plasmid (MCF7pcPAR4) and with empty vector (MCF7pcNEO) before and after treatment with docetaxel. To assess the interaction between the differentially expressed genes functional gene networks were generated using the IPA Ingenuity® software. Networks generated containing genes directly or indirectly related with the WNT signaling pathway (Wingless-Type MMTV Integration 1) were highlighted. The present study aims to validate the differentially expressed genes identified in MCF-7 cells with different PAR-4 expression before and after exposure of docetaxel. By manual annotation of the genes most differentially expressed, the genes EGR1, XAF1, TARP and WNT5A were selected to be validated by quantitative real time PCR (qRT-PCR). The platform WNT Signaling Pathway Human RT2 Profiler (TM) PCR Array (Array PCR) was used to evaluate the effect of PAR-4 overexpression and docetaxel treatment in gene expression of canonical and noncanonical WNT pathways. The positive expression of WNT5A in MCF7pcPAR4 cells relative to MCF7pcNEO was confirmed by qRT-PCR in the presence and absence of docetaxel. The EGR1 gene showed significant upregulation in the qRT-PCR in the absence of treatment, but showed a different expression profile of the one observed in the transcriptome assay. The XAF1 showed a negative regulation in MCF7pcPAR4 cells when compared with MCF7pcNEO cells in the absence and presence of docetaxel, showing a similar trend in the absence of treatment but opposed trend in the presence of docetaxel. It was observed a significant increase in TARP expression in MCF7pcPAR4 cells by qRT-PCR in the absence and presence of docetaxel, but these findings do not confirm the results of the transcriptome. PCR Array data of MCF7pcPAR4 vs MCF7pcNEO comparison before treatment, showed a significant expression difference in nine genes (p < 0.005). The genes CDKN2A, EGR1, FGF7, IL6 and TWIST showed positive expression and the genes NTRK2, SOX2, SOX9 and WISP1 had negative expression. In the presence of docetaxel it was observed that the genes CACNAD2A3, GDF5, IL6, FGF7, LEF1 and TWIST showed upregulation and FST downregulation with statistical significance (p < 0.005). From 84 genes of the platform PCR array we observed 21 and 14 common genes between both techniques in the absence and presence docetaxel, respectively. In the absence of docetaxel 16 genes showed similar expression profile, among them the upregulation of GJA1, IGF1, IGF2, LEF1, MMP2, PDGFRA, PTGS2 and TWIST, together with downregulation of CDH1, JAG1, NTRK2 suggest activation of the WNT/beta-catenin pathway. While the expression of DAB2, WNT5A, FZD7 and RUNX2 indicates inactivation of this pathway. In the presence of treatment six genes showed the same expression profile. Among these, the upregulation of CTGF, DAB2 EGR1 suggest the inactivation of Wnt/beta-catenin pathway. On the other hand, positive expression of FGF20, LEF1 and PDGFRA suggests that Wnt/beta-catenin would be active. In this study, we show that PAR-4 modulates genes of the WNT signaling pathway. However, more experiments are needed to clarify the role of WNT canonical and non-canonical pathways and how this reflects on drug chemosensitivit