Effects of spermatic concentration and volume in motion characteristics (CASA) and plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes (epifluorescence microscopy) of equine cryopreserved spermatozoa

É sabido das vantagens da utilização do sêmen criopreservado na reprodução eqüina, mas também é de conhecimento que o entendimento desta biotecnologia ainda é carente. Não se tem concordância quanto à dose e concentração espermáticas ideais para se obter bons resultados de fertilidade. Assim, este experimento teve o intuito de avaliar o movimento espermático pelo sistema computadorizado (CASA), a morfologia espermática, além da integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, com sondas fluorescentes, em espermatozóides eqüinos criopreservados nas concentrações de 100, 200, e 400x106sptz/mL e nos volumes 0,50 e 0,25mL. Foram utilizados quatro garanhões sendo oito colheitas de cada animal, através de vagina artificial. Após a colheita, o sêmen foi diluído em extensor à base de leite desnatado (1:1), centrifugado 500xg por 10 minutos, o sobrenadante retirado, e o pellet ressuspendido em diluidor Botu-Crio® nas concentrações de 100 (C100), 200 (C200) e 400x106sptz./mL (C400). Em seguida, envasado em palhetas de 0,50 e 0,25mL. Para criopreservação do sêmen utilizouse aparelho automatizado (TK3000®), com curvas de resfriamento -0,25ºC/min e de congelação -15ºC/min até -80ºC e -10ºC/min, até atingir -120ºC, quando as palhetas foram mergulhadas em N2 líquido (-196 ºC) e armazenadas em botijões criogênicos. Foram descongeladas duas palhetas de cada tratamento em banho-maria (37ºC por 30s). Uma amostra do sêmen foi diluída em formol salino para avaliação da morfologia espermática e outra em TALP sperm à concentração de 25x106sptz/mL. Logo após, uma amostra desta solução foi submetida à análise computadorizada do movimento espermático. As características analisadas foram: motilidade total (MTCA, %), motilidade progressiva (MPRO, %), velocidade progressiva (VSL, μm/s), velocidade curvilinear (VCL, μm/s), deslocamento lateral de cabeça (ALH, μm) e freqüência de batimento flagelar (BCF, Hz). Em seguida, uma outra amostra foi avaliada quanto à integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando PI, JC-1 e FITC-PSA, por microscopia de epifluorescência. Foram determinados os percentuais de espermatozóides com membranas plasmáticas intactas (MPI), acrossomais intactas (MAI) e mitocondriais de alto potencial (APM) e membranas plasmática e acrossomal intactas e com alto potencial de membrana mitocondrial (PIAIA). Foi utilizada análise de variância (ANOVA) (pC200>C400, exceto em LIN e STR. O volume somente alterou os valores de STR e VCL. Quanto à integridade e funcionalidade das membranas, não houve efeito do volume, enquanto que as concentrações alteraram somente MPI (C100>C200>C400) e APM (C100=C200>C400). Na morfologia espermática, a concentração somente afetou a percentagem de cauda dobra ou enrolada (C100>C200=C400) e o volume de armazenamento somente as quantidades de cabeça isolada normal e patológica (0,50>0,25mL). Assim, o melhor método de congelação, neste experimento, foi em C100, seguido por C200 e por último C400, em ambos os volumes. Portanto, a qualidade seminal pós-descongelação está diretamente relacionada com a quantidade de agentes crioprotetores por unidade celular, independente do volume da palheta.It has been known the advantages of cryopreserved semen utilization in equine reproduction, but the understanding of this biotechnology is uncertain yet. There was not agreement of the ideal spermatic dose and concentration to optimize fertility results. Thus this experiment had the objective to evaluate spermatic motion by computed analysis (CASA), spermatic morphology and the plasmatic and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential with fluorescence probes of equine cryopreserved spermatozoa on 100, 200 and 400x106sptz/mL concentrations and 0.50 and 0.25mL volumes. Eight ejaculates from four stallions were collected in artificial vagina. The semen was diluted in skim-milk extender (1:1), centrifuged at 500xg for ten minutes, the supernatant was removed and the freezing extender Botu-Crio® was added in the pellet to a final concentrations of 100 (C100), 200 (C200) and 400x106sptz/mL (C400); after that, it was packed in 0.50 and 0.25mL straws. The cryopreservation of semen utilized an automatic system (TK3000®), with cooling slope -0.25°C/minute and freezing slope of -15°C/minute, until -80°C, and -10°C/minute, until -120°C, when the straws were plunged into liquid nitrogen (-196°C), and stored in cryogenics tank. They were thawed for 30s in a 37°C waterbath. A sample of semen was diluted in saline formol to morphology spermatic evaluation and another diluted in TALP sperm at 25x106sptz/mL. After, a sample was submitted to CASA evaluation. The analyzed characteristics were: total motility (TMCA, %), progressive motility (PROM, %), progressive velocity (VSL, µm/s), track speed (VCL, µm/s), beat cross frequency (BCF, Hz) and lateral amplitude of head (ALH, µm). Afterward, another sample was evaluated about plasmatic and acrosomal membranes integrity and mitochondrial potential membrane, using PI, JC-1 and FITC-PSA by epifluorescence microscope. It was determined the spermatozoa percentage with intact plasmatic membranes (IPM), intact acrosomal membranes (IAM), and high potential mitochondrial membrane (HPM) and intact plasmatic and acrosomal membranes and with high potential mitochondrial membrane (IPIAH). For statistical analysis were utilized variance analysis (ANOVA - pC200>C400), except LIN and STR. The volume changed the values of percentage of STR e VCL. In membrane integrity and functionality there was no volume effect, however the concentrations changed only IPM C100>C200>C400) e HPM (C100=C200>C400). In spermatic morphology, the concentration affected the percent of folded or coiled tail (C100>C200=C400) and the volume only affected the loose normal and abnormal head (0.50>0.25mL). Thus, the better freezing method, in this experiment, was C100, followed by C200, and C400, in both straws volumes. The seminal quality post-thawed is related with the cryoprotector quantity by cell, free of the straw volume