Study of antineoplastic, cytotoxic and genotoxic activities of toxins isolated from Rhinella schneideri poison

Toxinas animais podem ser moléculas aplicáveis na geração de agentes terapêuticos e/ou de ferramentas para a pesquisa básica e aplicada. Recentemente, tem sido provado que medicamentos tradicionais chineses (TCM) compostos por substâncias extraídas de venenos de sapos são efetivos no tratamento de hepatocarcinoma e outros tipos de câncer. Desta forma, os objetivos deste estudo foram isolar toxinas do veneno do sapo Rhinella schneideri e avaliar suas ações antineoplásicas em diferentes linhagens celulares tumorais, além de avaliar a capacidade das toxinas em induzir instabilidade genômica (genotoxicidade e mutagenicidade). O veneno de Rhinella schneideri foi inicialmente submetido à diálise resultando na fração de baixa massa molecular (VRs), a qual foi submetida a uma cromatografia de fase reversa em coluna C18 em um sistema FPLC. Avaliou-se a citotoxicidade do VRs em linhagens celulares HL-60, HepG2, PC-12, B16F10, MCF-7, SKBr-3, L292 e em hepatócitos primários isolados de ratos Wistar, através do ensaio do MTT. Analisou-se também a influência do VRs em diversos parâmetros mitocondriais, através de experimentos realizados com mitocôndrias isoladas de fígados de rato. Adicionalmente, foram isoladas três toxinas do VRs, denominadas Rs1, Rs2 e Rs3, com as quais foram realizados ensaios de citotoxicidade com células tumorais HepG2 e hepatócitos primários, análise da dissipação do potencial de membrana mitocondrial, avaliação de indução de fragmentação nuclear, análise da distribuição do ciclo celular, ensaios de avaliação de apoptose/necrose utilizando anexina V (AV) e iodeto de propídeo (PI) e ativação das caspases 3, 8 e 9 por western blot. O VRs (0,01 - 1000 ?g/mL) foi citotóxico para quatro das seis linhagens tumorais estudas (B16F10, HepG2, HL-60 e Skbr-3), demonstrou interferir pouco na viabilidade de células não tumorais L929, e citotóxico para hepatócitos. O VRs não induz efeitos significativos nos parâmetros bioenergéticos e oxidativos das mitocôndrias isoladas de fígado de ratos sadios, o que é um indicativo que o VRs não induz efeito citotóxico a estas células através da via mitocondrial. Além disto, o VRs diminuiu o acúmulo de espécies reativas de oxigênio. Através da cromatografia de fase reversa foram isoladas três toxinas do VRs, dentre as quais duas (Rs1 e Rs3 [1-1000 nM]) demonstraram ser mais citotóxicas às células tumorais HepG2. Estas toxinas pouco ou nada interferiram na viabilidade celular de hepatócitos primários, característica extremamente importante para uma possível aplicação como agente antitumoral. Nos experimentos de dissipação do potencial de membrana mitocondrial vi e de fragmentação nuclear (características de células em apoptose) em células HepG2 ambas as toxinas se mostraram capazes de induzir a dissipação do potencial de membrana (de maneira concentração-dependente) e também causaram a condensação da cromatina e fragmentação nuclear. A análise da distribuição do ciclo celular em células HepG2 após o tratamento com Rs1 e Rs3 demonstrou que as toxinas induziram aumento da fase G2/M em menores concentrações (10- 50 nM), seguido de uma diminuição de células nesta fase e aumento em fase G0/G1 em maiores concentrações (100 - 1000 nM). A quantidade de células apoptóticas foi maior em concentrações maiores, porém não estabeleceu relação concentração-resposta. Os ensaios realizados com anexina V e PI, demonstram que ambas as toxinas são capazes de induzir as células HepG2 à morte, principalmente pelo processo de apoptose. Os ensaios de caspases 3, 8 e 9 confirmaram a ativação da apoptose tanto pela via intrínseca quanto pela via extrínseca. Os ensaios de mutagenicidade e genotoxicidade revelaram que ambas as toxinas não causaram danos ao DNA das células HepG2. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo indicam a seletividade dos efeitos citotóxicos das toxinas Rs1 e Rs3 pelas células tumorais HepG2, induzindo estas células à morte principalmente por apoptose, justificando o potencial uso destas duas toxinas em terapias antitumorais.Animal toxins can be applicable in generating therapeutic agents and/or tools for basic and applied research. Recently, it has been proved that traditional Chinese medicines (TCM) consisting of substances extracted from toad poisons have marked effect in the treatment of hepatocellular carcinoma and other cancers. Thus, the objectives of this study were to isolate toxins from Rhinella schneideri toad poison and evaluate their antineoplastic effects in different tumor cell lines, and to evaluate the ability of toxins to induce genomic instability (genotoxicity and mutagenicity). The poison from Rhinella schneideri was initially submitted to dialysis resulting in the fraction of low molecular weight (VRs), which was subjected to reverse phase chromatography on C18 column in a FPLC system. The cytotoxicity of VRs was assessed in cell lines HL-60, HepG2, PC-12, B16F10, MCF-7, SKBR-3, L292 and primary hepatocytes isolated from Wistar rats through MTT assay. The influence of VRs in various mitochondrial parameters was also evaluated through experiments with mitochondrias isolated from rat liver. Additionally, three toxins were isolated from VRs, named Rs1, Rs2 and Rs3, and cytotoxicity assays with tumor cells HepG2 and primary hepatocytes were performed with them. The analysis of mitochondrial membrane potential dissipation, nuclear fragmentation-inducing, evaluation of the cell cycle distribution, analysis of apoptosis/necrosis using annexin V (AV) and propidium iodide (PI) and activation of caspase 3, 8 and 9 by western blot were also performed. The VRs (0,01 - 1000 ?g/mL) showed to be cytotoxic to four of the six tumor cell lines studied (B16F10, HepG2, HL-60 and SKBR-3), showed little interference with the viability of non-tumor cells L929, and showed to be cytotoxic to primary hepatocytes. It was also observed that the VRs did not induce significant effects on bioenergetic and oxidative parameters of isolated mitochondria, which is an indication that the VRs did not induce cytotoxic effect on these cells via mitochondrial pathway. In addition, the VRs have showed to reduce the accumulation of reactive oxygen species. Three toxins were isolated from VRs by reverse phase chromatography and two of them (Rs1 and Rs3 [1-1000 nM]) have shown to be more cytotoxic to tumor cells HepG2. These toxins cause only a small decrease in cell viability of primary hepatocytes, an extremely important feature for a possible antitumor action. The experiments of mitochondrial membrane potential dissipation and nuclear fragmentation (apoptosis characteristics) in HepG2 cells showed that both toxins were able to induce dissipation of the membrane potential (dose-dependent manner) and also caused chromatin condensation and nuclear fragmentation. Cell cycle distribution analysis in HepG2 cells after treatment with Rs1 and Rs3 showed increase in G2/M phase at lower concentrations (10 - 50 nM), followed by a reduction of cells in this phase and increase in the G0/G1 phase at viii higher concentrations (100 - 1000 nM). The amount of apoptotic cells was greater at higher concentrations but did not establish dose-response relation. Assays performed with annexin V and PI showed that both toxins are able to induce HepG2 cell death mainly by apoptosis. The assays of caspases 3, 8 and 9 confirmed the activation of apoptosis by both the intrinsic an extrinsic pathways. Mutagenicity and genotoxicity tests revealed that both toxins caused no damage to the DNA of HepG2 cells. Thus, the results of this study indicate the selective cytotoxic effect of toxins Rs1 and Rs3 by tumor cells HepG2, inducing these cells to death mainly by apoptosis, justifying the potential use of these two toxins in antitumor therapies