In vitro performance of the bacterial manifestations on Eucalyptus benthamii Maiden & Cambage clones development

A presença de bactérias na base de microplantas estabelecidas in vitro, acarreta o descarte da cultura, tornando a técnica onerosa. Entretanto, há de se considerar que nem sempre a presença dos microrganismos afeta o desenvolvimento das plantas em diferentes fases da micropropagação, inferindo que essas colônias são resultantes de exsudações de endófitos da espécie cultivada. Neste contexto, o presente trabalho visou verificar as possíveis influências da manifestação bacteriana endofítica no desenvolvimento in vitro de clones de Eucalyptus benthamii. Para tanto, foram útilizados quatro clones (BP101; BP115, BP118 e BP120), em duas etapas de desenvolvimento: multiplicação e alongamento e, embora o processo in vitro fosse o principal foco da pesquisa, as análises estenderam-se para a fase de aclimatização, ou seja, desenvolvimento ex vitro. As microcepas foram mantidas in vitro sob dois tipos de manifestações bacterianas, as quais por sua vez, foram distintas quanto à coloração em: manifestação de colônias amarelas e manifestação de colônias brancas e, o controle, sem manifestação. Para compreender o desenvolvimento das microplantas na presença dos microrganismos, foram avaliados os parâmetros referentes ao incremento em massa seca, número de brotações, brotações alongadas e enraizamento, bem como características anatômicas e bioquímicas (produção de malondealdeído e teor de nitrogênio) das mesmas. Por meio da identificação molecular por BOX-PCR os isolados bacterianos foram agrupados e posteriormente identificados por sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. As linhagens bacterianas identificadas foram analisadas quanto à produção de AIA e fixação de nitrogênio, sendo as linhagens com os melhores resultados utilizadas na bacterização de microcepas de duas diferentes espécies de eucalipto (E. benthamii e E. cloeziana). Os resultados evidenciaram que nem toda presença microbiana in vitro é prejudicial às plantas micropropagadas, pelo contrário, observou-se que na maioria dos casos em E. benthamii, as manifestações possuem efeito neutro ou benéfico, promovendo o desenvolvimento das microplantas. As manifestações brancas e/ou amarelas constituíam uma associação de bactérias, com alta especificidade na interação endófito/microplanta. As análises moleculares identificaram similaridade com seis gêneros bacterianos: Curtobacterium (Actinobacteria), Bacillus e Aneurinibacillus (Firmicutes), Delftia (Betaproteobacteria), Bradyrhizobium, e Novosphingobium (Alphaproteobacteria), onde alguns deles mostraram-se comuns nos diferentes clones, sendo a Curtobacterium presente em todas as manifestações de todos os clones de E. benthamii analisados. Os resultados obtidos com a bacterização de diferentes espécies de eucalipto reforçam a especificidade da microbiota endofítica manifestada com seu hospedeiro, uma vez que a introdução de um isolado (inóculo) pode ocasionar alteração no equilíbrio do sistema de interação estabelecido, acarretando na redução ou simplesmente mantendo estável a taxa de crescimento das microplantas. Dessa forma, diante do atual panorama das biofábricas, as quais descartam inúmeras microplantas cultivadas in vitro em decorrência das manifestações bacterianas, evitar o descarte das microcepas e controlar sua manifestação, representa minimizar consideravelmente os prejuízos para as empresas e setores de pesquisas.The occurrence of bacteria growing together with microplants in vitro conditions frequently lead to discard of the material, increasing the costs on the micropropagation techniques. However, the microorganisms presence on the bacterial cultures do not always affect the plant development during the different phases of micropropagation because the bacteria colony probability are originated from self microplants as endophytic manifestations. This study evaluated the possible influences of the endophytic bacterian manifestation in the development of Eucalyptus benthamii growing on in vitro conditions. To access the evaluations were used four clones (BP101, BP115, BP118 e BP120) in two phases of microplants in vitro development: multiplication and elongation. The microstumps were grown under two different kinds of bacterial manifestations, distinguishable by colors in: white colony manifestations, yellow colony manifestations and no manifestations (control). To elucidate the microstumps development under the microorganisms presence, were evaluated referent parameters to the dry mass increasing, number of shoots, elongated shoots and rooting, as well as anatomical and biochemical characteristics alterations (malondialdehyde and nitrogen content). After bacterial isolation, they were grouped and identified by BOX-PCR, using partial sequencing of 16S rRNA gene. On the sets of the identified bacteria were analyzed for the AIA production and the nitrogen fixation, and those with better results were used to bacterizate another microstumps of two different Eucalyptus species (E. benthamii and E. cloeziana). The results indicate that the presence of in vitro microrganisms and microstumps together not always affect negatively the plant development. In opposite, bacterial manifestations brought benefits, stimulating the microstumps growth or do not affecting the growth of E. benthamii in vitro conditions. Actually, the white and yellow manifestations represents clusters of different bacteria, with high specificity in the interaction microstumps and endophytic. Molecular approaches identified through similarity analysis, six bacterial genus: Curtobacterium (Actinobacteria), Bacillus and Aneurinibacillus (Firmicutes); Delftia (Betaproteobacteria), Bradyrhizobium and Novosphingobium (Alphaproteobacteria). The occurrences of several of the bacteria were common among some clones, and Curtobacterium was present in all clones of E. benthamii analyzed. The results obtained by bacterization of two different Eucalyptus species confirmed that there is a high specificity between endophytic microorganisms\" manifestations and its host plants, because the artificial bacteria introduction can causes alterations on the equilibrium of the establishment system of plant-microorganism interactions, reducing or stabilizing growth rates on microstumps. Considering the current situation about the biofactories, which usually discard great amount of cultivate microplants in vitro because of the bacterial manifestation, it´s possible avoid these plant discard and make a control of their manifestations, with the intention to minimize substantially the losses in biofactories and also in research laboratories