Molecular identification of a phytoplasma associated with malformation of the leaves of Celosia argentea L. and Celosia spicata L.

Plantas de crista-de-galo (Celosia argentea) e pluma-de-flamingo (Celosia spicata) são ornamentais de flores exuberantes muito apreciadas. Recentemente, em logradouros públicos de Piracicaba (SP) foi observado que plantas de ambas as espécies exibiam sintomas típicos de doenças causadas por fitoplasmas, como redução foliar, superbrotamento de ramos laterais, enfezamento da parte aérea e filodia. Com o objetivo de demonstrar que tais organismos estavam associados à doença, o presente trabalho foi conduzido. Vinte e quatro amostras de folhas e ramos obtidas de plantas sintomáticas foram submetidas à extração do DNA total, o qual foi empregado para a detecção de fitoplasmas, conduzida por duplo PCR com os iniciadores P1/P7 ou P1/Tint e 16F2n/16R2. Plantas assintomáticas de celosia foram usadas como controle negativo, enquanto plantas de vinca experimentalmente infectadas por fitoplasmas serviram como controles positivos. Fitoplasmas foram detectados em 50% das plantas sintomáticas analisadas, através da amplificação de um fragmento genômico de 1,2 Kb, visualizado na forma de banda, em gel de agarose. Amplificações foram observadas para o controle positivo, porém nenhuma banda foi visualizada quando DNA de plantas assintomáticas foi usado na reação de PCR. O emprego de iniciadores específicos revelou que todos os fitoplasmas encontrados eram pertencentes ao grupo 16SrIII. Análises de RFLP, usando as enzimas HinfI, HpaII, TaqI, RsaI, KpnI, HaeIII, MseI, HhaI e Bsh 1236I e análises filogenéticas, baseadas na seqüência nucleotídica do 16S rDNA, confirmaram que o fitoplasma encontrados era afiliado ao grupo 16SrIII, subgrupo J. A transmissão experimental, via cuscuta, do fitoplasma presente em planta de crista-de-galo para planta de vinca evidenciou a natureza infecciosa da doença e que seu agente é, provavelmente, um fitoplasma.Plants belonging to the species Celosia argentea and Celosia spicata are appreciated as ornamentals due to their colorful flowers. Recently, plants of both species exhibiting typical symptoms induced by phytoplasmas, characterized by deformed leaves, proliferation of axillary shoots, stunt and phyllody were found in public places in Piracicaba, SP, Brazil. The present study was done to demonstrate that phytoplasmas were associated with these diseased plants. Twenty four samples composed by leaves and young shoots were obtained from symptomatic plants. Total DNA was extracted and used as template in nested PCR primed by P1/P7 or P1/Tint and 16F2n/16R2. Total DNA extracted from asymptomatic plants of celosia was used as negative control and plants of periwinkle experimentally infected with phytoplasmas were used as positive control. Phytoplasmas were detected in 50% of the symptomatic plants through the amplification of a genomic fragment of 1.2kb visualized as band in agarose gel. Amplification were also obtained for the positive control, but no band was visualized when DNA from asymptomatic plants was used in the PCR reactions. Nested PCR performed with specific primers pair revealed that the phytoplasmas found in all samples belonged to group 16SrIII. RFLP analyses conducted with the restriction enzymes HinfI, HpaII, TaqI, RsaI, KpnI, HaeIII, MseI, HhaI and Bsh 1236I, plus phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequences confirmed that the phytoplasma detected in diseased plants was affiliated to group 16SrIII, subgroup J. Positive experimental transmission of the phytoplasma from celosia to periwinkle, using Cuscuta subinclusa, indicated that the disease is infectious and that phytoplasma is, probably, the causal agent