Identification of antimicrobials compounds produced by actinomycetes from soil with potential application to control bovine mastitis

Neste trabalho foi explorado o potencial das actinobactérias como produtoras de agentes antimicrobianos contra bactérias causadoras da mastite bovina. Para este fim, foram otimizados dois diferentes bioensaios um de antagonismo e o outro de antibiose, contra 13 bactérias Gram-positivas e Gram-negativas relacionadas a mastite bovina. Através do bioensaio de antagonismo 120 actinobactérias foram triadas, sendo 55% delas consideradas ativas. Para o ensaio de antibiose foram triados 70 extratos brutos e 60% mostram a formação de halos de inibição. Os extratos brutos Caat 1-54, Caat 2-63 e Caat 8-25 foram considerados os mais promissores dentre todos os extratos estudados. Esses extratos brutos foram submetidos a estudos de desreplicação empregando LC-PAD-MS/MS e isolamento guiado por bioensaio para a identificação de seus metabolitos ativos. Os extratos Caat 1-54 e Caat 2-63 foram ativos principalmente contra as linhagens de bactérias Gram-positivas e a ação antimicrobiana observada foi atribuída a presença da lisolipina I e actinomicina D e V, respectivamente. O extrato Caat 8-25 foi ativo tanto contra bactérias Gram-positivas como para as Gram-negativas, sendo a oxitetraciclina associada a atividade contra as linhagens Gram-positivas e a herbicidina B ativo contra linhagens Gram-negativas. O estudo de desreplicação por LC-MS/MS também possibilitou a identificação de outros metabolitos secundários presentes nos diferentes extratos estudados. Para o extrato Caat 2-63 foi identificada a presença de outros peptídeos provenientes da via biossintética da actinomicina D e, no extrato bruto Caat 8-25 também foi identificado herbicidina F. Um estudo de mudança no metabolismo também foi realizado para a actinobactérias Caat 1-54 produtora de lisolipina. Através da suplementação de íons brometo no meio de cultivo em diferentes períodos da fermentação foi observada a produção de um análogo da lisolipina com bromo e da lisolipina clorada e bromada. Estudos de DESI-TLC-MS associado a bioautografia em TLC também foram aplicados para análise do extrato bruto Caat 2-63 e mostraram a potencialidade desta metodologia para acelerar a identificação de compostos ativos, pois a análise por espectrometria de massas na região da placa cromatográfica correspondente ao halo de inibição revelou a presença de actinomicina D e V, as quais já haviam sido associadas a atividade antimicrobiana deste extrato bruto. Assim os resultados obtidos nesta tese confirmam o grande potencial das actinobactérias como fonte promissoras de compostos bioativos e que a espectrometria de massas empregada nos seus diferentes modos de análise acelera o processo de identificação desses compostos.In this work were used two different bioassays to evaluate the antimicrobial potential of some actinomycetes against bacteria that cause bovine mastitis. For this propose an antagonism and antibiose assays were optimized against 13 Gram-positive and Gram-negative bacteria related with bovine mastitis. Through antagonism bioassay 120 actinomycetes were screened and 55% were considered active. In disk diffusion bioassay, 70 crude extracts were screened and 60% showed inhibition zones. The crude extracts Caat 1-54, Caat 2-63 and Caat 8-25 were considered the most promising of all the extracts. Dereplication studies and fractionation guided by bioassay were procedure with this extracts to identify the actives metabolites. The extracts Caat 1-54 and Caat 2-63 were active against strains of Gram-positive bacteria and the antimicrobial effect was related to lisolipin I and actinomycin D and V, respectively. The extract Caat 8-25 was active against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. Oxytetracycline were associated with activity against Gram-positives strains and a herbicidin B was active against Gram-negative bacteria. Using dereplication strategies by LC-MS/MS others compounds were characterized in different crude extracts. The extract Caat 2-63 was also identified the presence of other peptides from the same biosynthetic pathway of actinomycin D and for crude extract Caat 8-25 were identified herbicidin F. In addition, studies of the shift in secondary metabolism carried out for actinobacteria Caat 1-54 (lysolipin producer). Culture medium supplementation by bromide ions at different stages of fermentation induce the production of bromine lysolipin analog and a chloro-bromine lysolipin. DESI-MS TLC studies associated with TLC bioautography were used to analyze a crude extract Caat 2-63. This study showed how this method could be used to accelerate the identification of active compounds, because mass spectrometry analysis in situ at bioautigraphy inhibition zone showed the presence of actinomycin D and V, which had been associated with antimicrobial activity of this crude extract. Therefore, the results of this thesis confirm the potential of actinobacteria as bioactives compounds source and the importance of mass spectrometry experiments to accelerate the identification of these compounds