Study of angiogenesis and blood reperfusion after photodynamic therapy in chorioallantoic membrane model

A terapia fotodinâmica é uma técnica que utiliza uma substância fotossensibilizadora, luz de comprimento de onda adequado e oxigênio para produzir um efeito citotóxico, sendo uma alternativa aos tratamentos convencionais para o câncer. Este tratamento, quando realizado nos vasos sanguíneos, leva à destruição deles. No entanto, a recuperação dos vasos é observada algum tempo depois, o que pode ser um processo angiogênico (formação de novos vasos sanguíneos) induzido pela própria terapia. Os vasos sanguíneos fornecem oxigênio e nutrientes às células, levando ao crescimento de tecidos, inclusive tumorais. Para a investigação da angiogênese após a terapia fotodinâmica, foi utilizado o modelo de membrana corioalantoica de ovos de galinha, pois possui alta vascularização e fácil acesso aos vasos sanguíneos. A terapia fotodinâmica foi feita nos vasos da membrana com o fotossensibilizador Photogem®, em uma concentração de 10 μg/mL, e subdoses de luz para não levar o embrião à morte. As doses de luz de 6 e 15 J/cm2 foram estabelecidas para os experimentos e foi observada diminuição na densidade de vasos 3 horas após a terapia fotodinâmica, com um aumento 24 horas depois. Para a quantificação desses efeitos, uma rotina no MATLAB® foi elaborada para determinar a porcentagem de área ocupada pelos vasos sanguíneos nas imagens da membrana, que foram realizadas antes, a cada 30 minutos durante as primeiras 3 horas após o tratamento e 24 horas depois. Além disso, para uma análise da distribuição de grandes e pequenos vasos, o comprimento e o diâmetro de cada vaso nas imagens foram medidos com o software ImageJ®, que permitiu verificar que os menores vasos são os mais afetados 3 horas depois da terapia, com aumento no número desses vasos após 24 horas. Como isso poderia ser um indício de um processo angiogênico após a terapia fotodinâmica, marcadores de angiogênese foram utilizados em Western Blot. Apesar de esse método molecular não ter mostrado diferença entre o grupo com terapia fotodinâmica e os grupos controle, as análises por imagem indicam a formação de novos vasos 24 horas após a terapia, com uma rede vascular diferente da que havia antes.Photodynamic therapy is a technique that uses a photosensitizing substance, light of adequate wavelength and oxygen to produce a cytotoxic effect, being an alternative to conventional treatments for cancer. This treatment, when carried out in the blood vessels, leads to their destruction. However, vessel recovery is observed some time later, which may be an angiogenic process (formation of new blood vessels) induced by the therapy itself. The blood vessels supply oxygen and nutrients to the cells, leading to tissue growth, including tumoral. For the investigation of angiogenesis after photodynamic therapy, the chorioallantoic membrane model of chicken eggs was used, because it has high vascularization and easy access to the blood vessels. Photodynamic therapy was performed on membrane vessels with the Photogem® photosensitizer, at a concentration of 10 μg/mL, and light subdoses to avoid leading the embryo to death. Light doses of 6 and 15 J/cm2 were established for the experiments and a decrease in vessel density 3 hours after photodynamic therapy was observed, with an increase 24 hours later. For quantification of these effects, a routine in MATLAB® was designed to determine the percentage of area occupied by blood vessels in the membrane images, which were performed before, every 30 minutes for the first 3 hours after treatment and 24 hours later. Furthermore, for an analysis of the distribution of large and small vessels, the length and diameter of each vessel in the images were measured with the ImageJ® software, which allowed to verify that the smaller vessels are most affected 3 hours after the therapy, with an increase in the number of these vessels after 24 hours. Since this could be an indication of an angiogenic process after photodynamic therapy, angiogenesis markers were used in Western Blot. Although this molecular method showed no difference between the group with photodynamic therapy and the control groups, the image analysis indicates the formation of new vessels 24 hours after the therapy, with a vascular network different from before