Identification and functional characterization of genes from the Ammonium Transporter subfamily 2 (AMT2) in sugarcane (Saccharum spp.)

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) desempenha um papel de grande importância no cenário socioeconômico brasileiro, e representa 42% da matriz energética renovável do país. A expansão da área de cultivo da cana-de-açúcar para solos marginais e a necessidade de manutenção da alta produtividade dessa cultura tem levado à maior aplicação de fertilizantes a base de nitrogênio (N). Tal fato aliado à baixa responsividade da cana-de-açúcar a fertilizantes nitrogenados acarreta altos custos econômicos e ambientais. O amônio é a fonte preferencial de N para essa gramínea, sendo que pouco se conhece sobre a funcionalidade dos transportadores de NH4+ pertencentes à família gênica AMT (AMMONIUM TRANSPORTER). Neste contexto, é relevante esclarecer os mecanismos que influenciam na eficiência do uso de N (NUE), visando reduzir o impacto econômico e ambiental da aplicação dos fertilizantes nitrogenados nos sistemas agrícolas. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo a caracterização molecular e funcional de membros da subfamília AMT2 de cana-de-açúcar através de expressão heteróloga em mutantes de Saccharomyces cerevisiae (cepa 31019b) e Arabidopsis thaliana (qko), defectivos no transporte de amônio. As sequências gênicas e promotoras de ScAMT2;1 e ScAMT3;3A foram identificadas em biblioteca de BAC (bacterial artificial chromosome) de cana-de-açúcar (cultivar \'R570\'). Análises de expressão gênica de ScAMT2;1 e ScAMT3;3A em cana-de-açúcar demonstraram uma expressão preferencial em raízes e em folhas maduras, respectivamente, e que estes genes são regulados de maneira distinta entre si e entre os órgãos, de acordo com o desenvolvimento e com o status de N da planta. A complementação de levedura com os AMT2 de cana-de-açúcar demonstrou que estes genes restauram o crescimento do mutante, sendo que ScAMT2;1 permite maior absorção de amônio; porém o experimento não indicou sensibilidade dessas proteínas ao metilamônio (análogo tóxico ao amônio). Experimentos de localização da expressão órgão/tecido específico em arabidopsis selvagem \'Col-0\', utilizando os promotores de ScAMT2;1 ou ScAMT3;3A fusionados a GUS ou GFP, demonstraram que esses AMTs são preferencialmente expressos na região da endoderme/periciclo e vascular das células das raízes e região vascular da parte aérea, sendo regulados pela disponibilidade e fonte de N. Plantas de arabidopsis qko superexpressando ScAMT2;1, ScAMT3;3A ou transformadas com ScAMT2;1 dirigido por seu promotor endógeno, crescidas in vitro com amônio como fonte exclusiva de N, apresentaram um aumento significativo na produção de biomassa em relação a qko não transformada, principalmente para ScAMT2;1, indicando que essas proteínas são capazes de transportar amônio e complementar o mutante. Dados de influxo e acúmulo de 15N-amônio in vivo em raízes e parte aérea de plantas qko superexpressando ScAMT2;1 ou ScAMT3;3A demonstraram que ScAMT2;1 atua na absorção de amônio pelas raízes e provavelmente do carregamento do xilema, enquanto ScAMT3;3A está possivelmente envolvida na remobilização de amônio na parte aérea, podendo atuar aditivamente na absorção de NH4+ em raízes sob alto amônio. Esses resultados indicam que os transportadores ScAMT2;1 e ScAMT3;3A de cana-de-açúcar são funcionais, atuando com propriedades e funções distintas no transporte de amônio nessa gramínea e de acordo com a disponibilidade de N.Sugarcane (Saccharum spp.) plays a major role in the Brazilian socio-economic scenario, and represents 42% of renewable energy sources in the country. The expansion of sugarcane cultivation to marginal lands and the requirement to maintain high yields have led to increased application of nitrogen (N) fertilizer. This fact, coupled with the low response of sugarcane to N fertilization, entails high economic and environmental costs. Ammonium is the preferred source of N by this grass; however, little is known about the functionality of NH4+ transporters belonging to the AMT gene family (AMMONIUM TRANSPORTER). In this context, it is important to clarify the mechanisms that affect the nitrogen use efficiency (NUE) in order to reduce the economic and environmental impact of the application of N fertilizers in agricultural systems. Therefore, this study aimed to conduct the molecular and functional characterization of members of the AMT2 subfamily from sugarcane by heterologous expression in mutants of Saccharomyces cerevisiae (strain 31019b) and Arabidopsis thaliana (qko), both defective in ammonium transport. Gene and regulatory region sequences of ScAMT2;1 and ScAMT3;3A were identified in a bacterial artificial chromosome (BAC) library of sugarcane (cultivar \'R570\'). Expression analysis of ScAMT2;1 and ScAMT3;3A in sugarcane showed a preferential expression in roots and mature leaves, respectively, and indicated a distinct expression pattern between genes and organs according to the ontogeny and the N status of the plant. The yeast complementation with AMT2 of sugarcane demonstrated that these genes restore the mutant growth, with ScAMT2;1 enabling higher ammonium absorption; however, the experiment did not indicate sensitivity to methylammonium (toxic ammonium analog). Arabidopsis wild type \'Col-0\' transformed with the promoter region of ScAMT2;1 or ScAMT3;3A directing the expression of GUS or GFP, demonstrated preferential expression in the endodermis/pericycle regions of roots and vascular region in shoots, being regulated by the availability and source of N. Arabidopsis qko overexpressing ScAMT2;1, ScAMT3;3A or transformed with ScAMT2;1 driven by its endogenous promoter, grown in vitro with ammonium as the sole source of nitrogen, showed a significant increase in biomass production compared to untransformed qko, especially for ScAMT2;1, indicating that these proteins are capable of transporting ammonium and complementing the mutant. Data of 15N-ammonium influx and accumulation in vivo in roots and shoots of qko plants overexpressing ScAMT2;1 or ScAMT3;3A showed that ScAMT2;1 acts in ammonium uptake by roots and probably in the xylem loading, while ScAMT3;3A is possibly involved in ammonium remobilization in shoots, and may act additively in the absorption of NH4+ in roots under high ammonium. These results indicate that ScAMT2;1 and ScAMT3;3A from sugarcane are functional, working with distinct properties and functions in ammonium transport according to the availability of