Atividade biológica de uma nova formulação de anfotericina B solubilizada em nanofragmentos catiônicos de bicamada de brometo de dioctadecilmetilamônio

A prévia solubilização de anfotericina B (AnB) no versátil brometo de dioctadecildimetilamônio (DODAB), inspirou à avaliação da atividade in vivo de uma formulação DOD/AnB, a partir da análise de sobrevida e o estudo da colonização de órgãos no modelo murino. Nanofragmentos de bicamada obtidos por sonicação com ponteira, empregando 10 mg de DODAB por mL em água Milli-Q, solubilizaram concentrações de AnB ≤ 0,1 mg/mL, formando uma solução coloidal livre de solventes orgânicos. O estado de solubilização foi avaliado por espectrofotometria UV-visível e espalhamento de luz dinânimo, para medir o tamanho dos agregados. Nesta condição, a AnB foi estabilizada na sua forma monomérica produzindo o desaparecimento dos agregados insolúveis da droga. Em contraste com outras formulações lipídicas, a atividade in vivo de DOD/AnB foi equivalente à atividade da tradicional anfotericina B solubilizada em desoxicolato (DOC/AnB), quando administradas intraperitonealmente na dose de 0,4 mg/kg/dia durante 10 dias. Para o baço e rins, o estudo da recuperação de leveduras teve a mesma eficiência em reduzir o número de UFC/gr de tecido. A inexistência de informações sobre a atividade tóxica associada ao uso de DODAB, nos levou a estudar a toxicidade aguda, subaguda e crônica do carreador lipídico, assim como da formulação DOD/AnB, usando o esquema terapêutico previamente descrito. Foram avaliadas a citotoxicidade para células epiteliais renais, e a função hepática e renal junto com as alterações hematológicas e histopatológicas no modelo Swiss webster. In vitro, DOD/AnB apresentou menor citotoxicidade contra células renais em comparação ao convencional DOC/AnB. In vivo, após tratamento com DOD/AnB, a única alteração histológica observada no rim foi a presença de um infiltrado inflamatório na região cortical renal, enquanto o uso de DOC/AnB gerou uma precoce lesão tubular progredindo para um dano glomerular degenerativo. Independentemente da incorporação de AnB, DODAB gerou uma resposta pró-inflamatória generalizada (imunoestimulante) com a formação de um granuloma no sítio de inoculação e um aumento da cápsula esplênica, além de neutrofilía. Em resumo, DOD/AnB foi tão efetivo quanto o tratamento com DOC/AnB no tratamento da candidíase sistêmica no modelo murino, sendo mais barato que outras formulações lipídicas disponíveis comercialmente. A solubilização monomérica e estabilização da AnB em fragmentos de bicamada, na ausência de solvente, apresentou menor nefrotoxicidade em comparação ao DOC/AnB, embora há necessidade de modificações com o objetivo de aumentar a incorporação da droga, diminuindo a concentração do anfifílico, reduzindo os efeitos adversos observados no presente estudo, de modo que esta formulação possa competir com aquelas comercialmente disponíveis.Solubilization of amphotericin B (AMB) by dioctadecyldimethylammonium bromide (DODAB) bilayer fragments inspired this evaluation of its in vivo activity from survival and tissue burden experiments against systemic candidiasis in a mouse model. AMB (≤0.1 mg/mL) was simply added to a DODAB powder dispersion in water (10 mg/mL) previously prepared by sonication with tip; organic solvents completely absent. AMB aggregation state was evaluated from UV-visible light absorption and dynamic light scattering for aggegate sizing. AMB was stabilized by the DODAB bilayer fragments in its monomeric form, mixing of AMB and DODAB dispersion in pure water causing disappearance of large water insoluble drug aggregates. From survival experiments, both the bilayer, DOD/AMB, and the traditional deoxycholate/AMB formulation (DOC/AMB), had identical effect when given by the same route at the same dose of 0.4 mg/kg/day given i.p. for 10 days. From spleen and kidneys tissue burden experiments, similar efficacy of both preparations in reducing tissue CFU counting was obtained. The inexistence of information on DODAB toxicity led us to study the acute, subacute and chronic toxicity of the lipidic carrier as well as of the DOD/AMB formulation using previously described treatment. Cytotoxicity to renal epithelial cells as well as hepatic and renal function and histopathological and hematological alterations were evaluated in Swiss webster mice. In vitro, DOD/AMB presented the smaller cytotoxicity against the renal cell compared to the conventional DOC/AMB. In vivo, after treatment with DOD/AMB the only histological alteration observed in the kidney was the presence of an inflammatory infiltrate in the renal cortical region, while the use of DOC/AMB additionally generated a precocious tubular lesion which progressed to a degenerative glomerular damage. Independent of the incorporation of AMB, DODAB generated a generalised pro-inflammatory (immunostimulant) response with the formation of a granuloma in the site of innoculation, an increase of the splenic capsule and neutrophilia. In summary, DOD/AMB was as effective as DOC/AMB for treating systemic candidiasis in a mouse model and it is cheaper than other commercially available lipidic formulations. The monomeric solubilisation and stabilisation of AMB in the bilayer fragments, without solvents, presents a smaller nefrotoxicity in comparison to DOC/AMB, however, there is the need of modification in order to increase the incorporation of the drug, decreasing the concentration of the amphiphile, thus reducing the adverse effects observed in this study so that this formulation can compete with commercially available ones