Evaluation of the interference of the antioxidant effect of carvedilol, a potential nephroprotector, in the antitumor activity of cisplatin

A cisplatina é um dos mais efetivos agentes antitumorais, porém seu uso clínico é limitado principalmente pela nefrotoxicidade. A terapia adjuvante com antioxidantes tem sido sugerida como estratégia de proteção contra a toxicidade induzida pela cisplatina nos tecidos saudáveis, e a eficácia de diferentes antioxidantes tem sido demonstrada em diversos modelos experimentais. Entretanto, a maioria dos compostos descritos como citoprotetores não foi ainda avaliada em modelos experimentais portadores de tumores e não há um consenso sobre o impacto da terapia antioxidante na atividade antitumoral da cisplatina. Além disso, há poucos dados sobre o efeito de muitos destes citoprotetores sobre a saúde humana, sendo que alguns podem apresentar atividade pró-oxidante sob determinadas condições. Nossos estudos anteriores demonstraram que o beta-bloqueador carvedilol protege eficazmente contra a nefrotoxicidade induzida pela cisplatina em ratos. No presente estudo foram explorados dois novos aspectos da proteção exercida pelo carvedilol: (a) o efeito da carvedilol na atividade antitumoral da cisplatina e (b) os mecanismos moleculares de proteção. O primeiro aspecto foi avaliado in vivo em camundongos portadores de Sarcoma 180. Neste modelo, quatro grupos (n=8) de camundongos Swiss, machos adultos, inoculados com uma suspensão de células de Sarcoma 180 (via subcutânea) foram submetidos aos seguintes tratamentos: (I) Grupo Controle: carboximetilcelulose 0,5% (0,10mL/ animal 30g, via oral ou v.o, 1 vez ao dia, por 3 dias) e solução salina (0,75mL/animal 30g, intraperitoneal ou i.p. no primeiro dia) ; (II) Grupo Cisplatina (Cisp): cisplatina (25 mg/kg, i.p., no primeiro dia); (III) Grupo Carvedilol+Cisplatina (CV+Cisp): carvedilol (10 mg/kg, v.o, 1 vez ao dia, por 3 dias) e cisplatina (25 mg/Kg, i.p., no primeiro dia); e (IV) Grupo Carvedilol (CV): carvedilol (10 mg/kg, v.o., 1 vez ao dia, por 3 dias). A função renal (uréia e creatinina plasmáticas), e a análise histopatológica do tecido renal comprovaram o dano renal induzido pela cisplatina e a nefroproteção exercida pelo carvedilol. A biodistribuição da platina (ICP-MS) e a atividade antitumoral da cisplatina (índice de remissão tumoral e curva de sobrevida) não foram alteradas pelo carvedilol. O carvedilol não protegeu contra a mutagenicidade (avaliada em sangue periférico) e contra a mielossupressão induzidas pela cisplatina. O ensaio de TUNEL e análise imuno-histoquímica da caspase-3 clivada e da proteína pró-apoptótica Bax comprovaram a proteção do carvedilol contra a apoptose que foi induzida pela cisplatina no tecido renal, porém a proteína anti-apoptótica Bcl-xL permaneceu inalterada nos quatro grupos. O envolvimento da atividade antioxidante do carvedilol no mecanismo de proteção foi demonstrado pelos ensaios de peroxidação lipídica e GSH no tecido renal. Os estudos mecanísticos foram realizados em modelo in vitro com células HK-2 (de rim humano normal) divididas em quatro grupos de tratamento: (I) Controle: salina tamponada com fosfato (PBS); (II) Cisp: 25?M de cisplatina; (III) CV+Cisp: 50?M de carvedilol e 25 ?M de cisplatina; (IV) CV: 50 ?M de carvedilol. Foi observada diminuição da morte celular por apoptose e da expressão das proteínas caspase-3, pro-caspase-9 e Bax no grupo CV+Cisp quando comparado ao grupo Cisp. Assim como nos estudos in vivo, não houve alteração na expressão da ii proteína Bcl-xL. A atividade da proteína SIRT-1 apresentou-se aumentada no grupo CV+Cisp e inalterada nos demais. Adicionalmente, o mecanismo antioxidante do carvedilol foi associado ao sequestro dos íons ferrosos, mas não ao sequestro de radicais livres. Em conclusão, a atividade nefroprotetora do carvedilol está associada a mecanismos antioxidantes provavelmente decorrentes do sequestro de íons ferrosos. O mecanismo nefroprotetor do carvedilol não diminui a atividade antitumoral da cisplatina, o que sugere que mecanismos distintos sejam responsáveis pela nefrotoxicidade e pela atividade antitumoral da cisplatina. Ainda, o estresse oxidativo parece desempenhar papel central na nefrotoxicidade, o que não acontece na atividade antitumoral, que tem sido associada principalmente a danos ao DNA nuclear. Estes resultados sugerem que a terapia antioxidante pode ser uma alternativa segura na proteção dos tecidos saudáveis durante a quimioterapia com cisplatina.Cisplatin is one of the most effective anticancer agents; however, its clinical use is limited mainly by its nephrotoxicity. The adjuvant therapy with antioxidants has been suggested as a strategy of protection against the toxicity induced by cisplatin in healthy tissues and the efficacy of different antioxidants has been demonstrated in several experimental models. However, most of these compounds described as cytoprotectors have never been tested in tumor-bearing models, and there is not a consensus on the impact of the antioxidant therapy on the antitumor activity of cisplatin. Moreover, there are few data about the effect of many of these compounds on human health; some can even display pro-oxidant activity under certain conditions. Our previous studies have demonstrated that the beta-blocker carvedilol efficiently protects against the nephrotoxicity induced by cisplatin in rats. In the present study two new aspects of the protection of carvedilol were explored: (a) the effect of carvedilol on the antitumoral effect of cisplatin and (b) the molecular mechanisms of protection. The first aspect was evaluated in vivo in Sarcoma-180-tumor-bearing mice. In this model, four groups groups (n=8) of Swiss, adult mice, inoculated with Sarcoma-180 cells (subcutaneous via) were treated as follows: (I) Control group: carboxymethylcellulose 0.5% (0.10mL/ 30g animal, oral, once a day, 3 days) and saline solution (0.75mL/30g animal, intraperitoneal or ip, on the first day); (II) Cisplatin group (Cisp): cisplatin 25mg/kg, i.p., on the first day; (III) Carvedilol + Cisplatin group (CV+Cisp): carvedilol (10mg/kg, oral, once a day, 3 days) and cisplatin (25 mg/kg, i.p., on the first day); (IV) Carvedilol group (CV): carvedilol (10mg/kg, oral, once a day, 3 days). The renal function (plasmatic BUN and creatinine) and the renal histopathology, showed the renal damage induced by cisplatin and the nephroprotection of carvedilol. The biodistribution of platinum (ICP-MS) and the antitumor activity of cisplatin (tumor remission index and survival curve) were not altered by carvedilol. Carvedilol did not protect against the mutagenicity (evaluated in the peripheral blood) and the bone marrow suppression induced by cisplatin. TUNEL assay and the imunnohistochemical analyses of the cleaved caspase-3 and the proapoptotic protein Bax showed the protection of carvedilol against the apoptosis induced by cisplatin in the renal tissue; however, the anti-apoptotic protein Bcl-xL remained unaltered in the four groups. The involvement of the antioxidant activity of carvedilol in the protective mechanism was demonstrated by lipid peroxidation and GSH assays in the renal tissue. The mechanistic studies were performed in vitro in HK-2 cells (from normal human kidney) divided into four groups of treatment: (I) Control: phosphate buffered saline (PBS); (II) Cisp: 25?M cisplatin; (III) CV+Cisp: 50?M carvedilol and 25 ?M cisplatin; and (IV) CV: 50 ?M carvedilol. Reduced cell death by apoptosis and reduced expression of caspase-3, pro- caspase-9 and Bax were observed in CV+Cisp as compared to Cisp. Similarly to the in vivo studies, no alterations in the expression of Bcl-xL were observed. The activity of SIRT-1 was increased in the group CV+Cisp, but was unaltered in all the other groups. Additionally, the antioxidant mechanism of carvedilol was associated with the scavenging of ferrous ions but not with the scavenging of free radicals. In conclusion, the nephroprotective activity of carvedilol is associated with antioxidant iv mechanisms which probably results from the scavenging of ferrous ions. The nephroprotective mechanism of carvedilol does not reduce the antitumor activity of cisplatin, which suggests that distinct mechanisms are responsible for the nephrotoxicity and the antitumor activity of cisplatin. Moreover, the oxidative stress might play a central role in the nephrotoxicity, but this does not happen in the antitumor activity, which has been associated mainly with nuclear DNA damage. These findings suggest that the antioxidant therapy might be a safe alternative to protect healthy tissues during cisplatin chemotherapy