Apoptotic potential of a new amphiphilic chlorine as photosensitizer for photodynamic therapy

A Terapia Fotodinâmica (PDT) é uma técnica utilizada para tratar vários tipos de tumores em que a luz estimula um fotossensibilizador (FS) a gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) que levam à morte celular por apoptose ou necrose. A partir de uma clorina (CHL), cuja nomenclatura é metilfeoforbídio, visando torná-la mais anfifílica foi adicionado o grupo TRISMA (CHL-T). Os vários parâmetros usados na PDT (tipo de FS, concentração do FS, tempo de incubação do FS e dose de luz) podem desencadear diferentes vias para apoptose. Poucos estudos sobre o tipo de morte celular induzido com clorinas têm sido realizados. Diante disso, o objetivo deste estudo foi determinar a citotoxicidade dessa nova clorina, assim como identificar o tipo de morte celular envolvido na PDT e elucidar a participação da proteína apoptótica p53 nesse processo comparando-se com CHL e HY. A hipótese principal deste trabalho é que esta nova clorina modificada tem maior eficiência na indução de apoptose. Para testar esta hipótese, foi avaliada a indução de apoptose por microscopia de fluorecência e por citometria e a citotoxicidade pelo ensaio do MTT de três FSs: uma clorina (CHL), a clorina modificada (CHL-T) e a hipericina (HY). As clorinas apresentaram maior acumulação para as duas linhagens celulares quando comparada com a hipericina. A fototoxicidade apresentada pela nova clorina foi cerca de 10 a 20 vezes maior que a clorina de origem (CHL) nas duas linhagens celulares como demonstrado pelos resultados do ensaio com MTT. Os testes realizados por microscopia de fluorescência resultaram numa porcentagem de morte celular crescente com o aumento das concentrações diferenciando maior apoptose causada por PDT com CHL-T nas células HEp-2 e maior necrose nas células HeLa. A análise da apoptose por citometria também apresentou um efeito muito superior da CHL-T em relação aos demais FSs estudados para apoptose inicial (80,35%) para a concentração de 0,52 \'mü\'M, tempo de incubação de 2h e dose de luz 6 J/\'CM POT.2\'. Já a detecção de ROS por citometria não apresentou diferenças estatisticamente significativas para PDT nessas condições. Um discreto aumento na ativação de p53 com CHL-T e irradiação foi observado, porém não estatisticamente significativo. Os resultados sugerem que a indução da morte celular na PDT não depende dessa proteína e que a CHL-T tem excelente desempenho como FS em PDT.Photodynamic therapy (PDT) is a technique used in the treatment of various types of tumors in that light stimulates a photosensitizer (PS) to generate reactive oxygen species (ROS) that lead to cell death by apoptosis or necrosis. From a chlorine (CHL), whose nomenclature is methylfeoforbidio, hoping to make it over the amphiphilic the TRISMA group (CHL-T) has been added. Several parameters (type of PS, concentration of PS, incubation time and light dose) can trigger different apoptotic pathways. Few studies aiming the type of cell death induced by chlorines as a PS have been done. Thus, the objective of this project was to determine the cytotoxicity of this new chlorine, as well as identify the type of cell death involved in PDT as well as to elucidate the involvement of apoptotic protein p53 in this process comparing with CHL and HY. The main hypothesis of this study is that the modified chlorine has greater efficiency in the induction of apoptosis. To test this hypothesis, it was evaluated the induction of apoptosis by fluorescence microscopy and cytometry and the cytotoxicity by the MTT assay of three PSs: chlorine (CHL), the modified chlorine (CHL-T) and hypericin (HY).The chlorins accumulation was higher for the two cell lines compared with hypericin. Phototoxicity presented by the chlorin was about 10 to 20 times greater than by the chlorine source (CHL) for the two cell lines as demonstrated by the MTT assay. Tests conducted by fluorescence microscopy showed the percentage of cell death increased with increasing concentrations distinguishing higher apoptosis caused by PDT with CHL-T in HEp-2 cells and higher necrosis in HeLa cells. Analysis of apoptosis by flow cytometry also showed a superior response of CHL-T comparing to the others two studied PSs for initial apoptosis (80.35%) for concentration of 0.52 mM, incubation time of 2h and light dose 6 J/\'CM POT.2\'. However the detection of ROS by flow cytometry showed no statistically significant values for PDT in these conditions. A slight increase in the activation of p53 for CHL-T and irradiation was observed, but without being statistically significant. Thus, the results suggest that the induction of cell death in PDT does not depend on this protein and that CHL-T has excellent performance as a PS in PDT