Influence of diabetes on the activity and distruition of the enzimes hexokinase and phosphofructokinase of the rat parotid and submandibular gland

Na presente investigação estudamos a possível influência da falta da insulina sobre a atividade de duas enzimas importantes para a via glicolítica: a hexoquinase (HK) e a fosfofrutoquinase-1 (PFK-1), nas glândulas submandibular (GLSM) e parótida (GLPA) de ratos. Para isso, em ratos mantidos em jejum durante aproximadamente 15 horas foi injetado, via intraperitonial, estreptozotocin dissolvido em tampão citrato 0,1M pH 4,5 (60 mg/Kg de peso corporal). 48 horas após a indução, o sangue dos animais foi coletado e a glicemia determinada. Somente aqueles ratos que apresentaram glicemia igual ou acima de 350mg de glicose/100 ml de sangue foram utilizados. Os animais foram sacrificados 30 dias após a indução do estado diabético, por traumatismo craniano. As GLSM e GLPA foram removidas e analisadas para atividade e distribuição das enzimas HK e PFK-1. A enzima HK foi determinada no citosol (fração solúvel) e ligada a mitocôndria (fração ligada). A enzima PFK-1 foi determinada no citosol (fração solúvel) e ligada ao citoesqueleto (fração ligada) em dois pHs: pH 6,9, sujeito a regulação alostérica e pH 8,2, em que mostra atividade máxima. Na GLPA observamos aumento da atividade da HK tanto na fração solúvel (aproximadamente 33%) quanto na fração ligada a mitocôndria (aproximadamente 85%). Relativamente a isoenzimas de HK, não verificamos alteração no estado diabético. A atividade da enzima PFK-1 na GLPA não apresentou alterações quer considerando a forma sujeita a regulação alostérica, quer a forma com atividade máxima e portanto, não sujeita a regulação. Na GLSM constatamos uma redução da enzima HK ligada a mitocôndria de aproximadamente 74%, não havendo alteração da forma determinada no citosol (forma solúvel). Relativamente às formas isoenzimáticas, verificamos a perda de uma forma isoenzimática tanto na fração solúvel quanto na fração ligada. Por outro lado, observamos um aumento da atividade da PFK-1 da fração solúvel de aproximadamente 50% quando determinada em pH 6,9, que reflete a forma regulada alostericamente, e de aproximadamente 84% quando determinada em pH 8,2 e, portanto, não sujeito a regulação. Contrariando ao esperado, o conteúdo de Fru-2,6-P2 nas GLSM de ratos diabéticos apresentou redução de aproximadamente 42% enquanto a atividade da PFK-2 também apresentou redução.We have studied in the present investigation a possible influence of the diabetic state of the rats on the activity of two important enzymes of the glycolitic pathway, namely, the HK and PFK-1 of the submandibular and parotid gland. The diabetic state was induced by an injection of streptozotocin (60mg/Kg body weight) dissolved in 0,1M citrate buffer pH 4,5 in rats overnight fasted. Forty-eight hours after the injection, blood was collected and the glucose determined. Only those animals presenting a blood glucose equal or above 350mg glucose/100ml blood we used in this experiment. The animals were sacrificed by cranial traumatism, thirty days after the induction of the diabetes, the submandibular and parotid glands were removed and analyzed for activity and distribution of the enzymes HK and PFK-1. The activity of the enzyme HK was determined in the cytosol (soluble fraction) and bound to mitochondria (solubilized fraction). The activity of the enzyme PFK-1 was determined in the cytosol (soluble fraction) and bounded to cytoscheletal (bound fraction)at two pHs, pH 6,9 that respond to allosteric regulation and pH 8,2 in which it show maximum activity. In the parotid gland it was observed an increase in the HK activity in both fractions, soluble and bond to mitochondria, of about 33% and 85% respectively. It was not possible to observe alterations in the isoenzymes profile. The activity of PFK-1 in the parotid gland showed no variation either considering the soluble fraction on the bound form, at both pHs in which it was determined. In the submandibular gland, it was verified a reduction of the bound HK of about 74%, but no variation in the soluble form. Concerning the isoenzymes, it was observed the disappearance of an isoenzyme in both fraction. On the other hand, we observed an increase in the activity of PFK-1 of the soluble fraction of about 50%, when determined at pH 6,9, pH in which it respond to allosteric control, and about 84% when determined at pH 8,2. Contrary to what it was expected, the content of Fru-2,6-P2 were reduced in the submandibular gland of diabetic rats