Molecular monitoring of Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) in sugarcane plantations

O objetivo deste estudo foi caracterizar a diversidade de Metarhizium em um plantio de cana-de-açúcar e monitorar a eficácia e persistência do isolado ESALQ 1604 de M. anisopliae, após aplicação em campo, através de técnicas moleculares. Isolados foram recuperados de amostras de solo, raiz e cigarrinha-das-raízes infectadas de duas áreas de um canavial em Iracemápolis-SP, uma com aplicação do fungo (isolado ESALQ 5310) e colheita mecânica e outra sem aplicação e colheita manual antecedida por queimada. Os isolados de insetos foram recuperados de ninfas e adultos coletados 51, 42 e 1 dia (s) antes da aplicação do fungo e 7, 30, 60 e 90 dias após a aplicação. Isolados de solo e raiz foram obtidos 90 dias pré-aplicação do fungo e 30 e 90 dias pós-aplicação. A aplicação de M. anisopliae foi realizada em 09/01/15 com suspensão de 3,72x106 conídios viáveis/mL numa vazão de 150L/ha. Nas análises moleculares também foram incluídos 22 isolados provenientes das mesmas áreas coletados em 18/12/2012. A diversidade haplotípica de Metarhizium foi obtida pela genotipagem de 10 marcadores microssatélites para 213 isolados provenientes de amostras de solos, 22 de raízes e 73 de cigarrinha-das-raízes. A identificação específica dos fungos foi obtida pelo sequenciamento do gene 5\'-TEF de 57 isolados provenientes de solos, 6 de raízes e 14 de cigarrinha-das-raízes selecionados dentre os diferentes haplótipos gerados pelas análises dos marcadores microssatélites. Dentre os 310 isolados genotipados, foram obtidos 156 haplótipos do fungo, destes, 132 provenientes de isolados de solo, 17 de raízes e 20 de cigarrinha-das-raízes. A maior diversidade haplotípica foi encontrada nos solos h=0,989 e a menor em insetos h=0,779. A divergência genética entre isolados provenientes de insetos, solos e raízes foi significativa (ΦST =0.303), sendo a maior proporção da variação dentro (69,6 %) do que entre (30,3 %) esses grupos. A mortalidade de cigarrinha-das-raízes por M. anisopliae antes da aplicação variou de 0 a 14,8% para ninfas e 7,3-18,1% para adultos. Sete dias após a aplicação, observou-se 50% de mortalidade confirmada de ninfas e 10,7% de adultos. O isolado aplicado em campo foi recuperado somente em cigarrinha-das-raízes e nas coletas 7, 30 e 60 dias pós-aplicação, compreendendo 50%, 50% e 70,5% de todos os insetos mortos por M. anisopliae, respectivamente. A população da praga reduziu após 90 dias e não foram observadas cigarrinhas infectadas nesta amostragem. No solo, foram encontradas as espécies M. robertsii (clados Mrob 1, Mrob 2 e Mrob 4), M. anisopliae (Mani 1 e Mani 2) e M. brunneum. Em raízes foram encontradas as espécies M. brunneum e M. anisopliae (Mani 2). Em adultos e ninfas de cigarrinha-das-raízes foram encontrados somente haplótipos de um único clado (Mani 2) de M. anisopliae, e o isolado ESALQ 5310 aplicado nos anos anteriores na área não foi recuperado. Os resultados obtidos neste trabalho revelam a grande diversidade haplotípica de Metarhizium spp. e o impacto das populações locais de M. anisopliae na regulação de cigarrinhas em cana-de-açúcar.The aim of this study was to characterize the diversity of Metarhizium in a sugarcane plantation and to monitor the efficacy and persistence of the isolate ESALQ 1604 of M. anisopliae after field application, by molecular techniques. Isolates were recovered from samples of soil, root and infected spittlebugs of two areas in Iracemápolis-SP: one with application of the fungus (isolate ESALQ 5310) and mechanical harvesting and another without fungal application and manual harvest preceded by burning. The isolates from insects were recovered from nymphs and adults collected 51, 42 and 1 day (s) before application of the fungus and 7, 30, 60 and 90 days after application. Isolates of soil and root were obtained 90 days pre-application of the fungus and 30 and 90 days post-application. The application of M. anisopliae was carried out in 9/Jan/15 with suspension of 3,72 x 106 viable conidia/mL at a volume rate of 150 l/ha. In the molecular analyses, 22 isolates from the same areas collected in 18/12/2012 were also included. The haplotype diversity of Metarhizium was obtained by genotyping 10 microsatellite markers of 213 isolates from soil samples, 22 from roots and 73 from spittlebugs. The specific identification of fungi was obtained by sequencing the gene 5\'- TEF of 61 isolated from soil, 6 from root and 13 from spittlebug selected among the different haplotypes generated by analysis of microsatellite markers. Among 310 isolates genotyped, 156 haplotypes of the fungus were obtained, of these, 132 from soil isolates, 17 of root and 20 of spittlebug. The highest haplotype diversity was found in soil h=0.989 and the smallest in spittlebug h = 0.779. The genetic divergence among isolates from insect, soil and root was significant (ΦST = 0.303), being the largest proportion of the variation within (69.6%) than among (30.3%) these groups. The mortality of spittlebugs by M. anisopliae before application ranged from 0 to 14.8% for nymphs and 7.3-18.1% for adults. Seven days after application, 50% of nymph mortality and 10.7% of adult mortality was observed. The isolate applied on the field was recovered only in spittlebugs and only 7, 30 and 60 days, post-application, and accounted for 50%, 50% and 70.5% of all insects killed by M. anisopliae, respectively. The pest population reduced after 90 days and no spittlebug infected was observed in this sample date. The species and clades found in isolates from soil were M. robertsii (clades Mrob 1, Mrob 2 and Mrob 4), M. anisopliae (Mani 1 and Mani 2) and M. brunneum. In roots the species found were M. brunneum and M. anisopliae (Mani 2). In adults and nymphs of spittlebug only haplotypes of a single clade (Mani 2) of M. anisopliae were found. The isolate ESALQ 5310 applied in previous years in the area was never recovered. The results obtained in this work revelead the great diversity of haplotype Metarhizium spp. and the impact of local populations of M. anisopliae on population regulation of spittlebugs in sugarcane