DICER1 and TARBP2 gene analysis in adult and pediatric adrenocortical tumors

NTRODUÇÃO: O carcinoma cortical da suprarrenal é uma neoplasia rara com uma incidência estimada em 0,5-2,0 por milhão por ano em adultos. No momento, poucas opções terapêuticas para os pacientes com doença metastática são disponíveis, e novas descobertas sobre a sua patogênese são necessárias. O perfil de expressão gênica dos microRNAs (miRNAs) em tumores humanos tem sido caracterizado por uma redução global da expressão dos miRNAs. A enzima DICER1 e seu cofator TRBP (codificado pelo gene TARBP2) estão envolvidos em uma etapa essencial do processamento dos miRNAs. De forma interessante, a desregulação do processamento dos miRNAs em células cancerosas devido ao silenciamento da DICER1 propiciou a emergência de células com fenótipo mais agressivo, acelerando a progressão tumoral. Recentemente, mutações somáticas missense recorrentes no domínio de clivagem RNase IIIb da enzima DICER1 foram identificadas em 29% tumores de ovários não-epiteliais esteroidogênicos (e em até 60% de tumores ovarianos de células de Leydig). Adicionalmente, mutações inativadoras no éxon 5 do gene TARBP2, com consequente prejuízo da função da DICER1, foram identificadas em linhagens celulares de tumores com instabilidade cromossômica. OBJETIVOS: Determinar a expressão gênica e proteica da DICER1 e TRBP em tumores do córtex da suprarrenal de adultos e crianças; Investigar variantes genéticas no domínio de clivagem RNAse IIIb do gene DICER1; Investigar variantes genéticas no éxon 5 do gene TARBP2; Estudar a expressão dos miR-103 e miR-107, envolvidos na regulação da DICER1, e do miR-497, envolvido na regulação da TRBP. MÉTODOS: A expressão proteica da DICER1 e da TRBP foi avaliada por imunohistoquímica em uma micromatriz tecidual contendo 198 tumores do córtex da suprarrenal [154 em adultos (75 adenomas e 79 carcinomas) e 44 em crianças (38 clinicamente benignos e 6 clinicamente malignos)]. A expressão gênica da DICER1 e TARBP2 foi avaliada em um subgrupo de 84 tumores (61 adultos e 23 pediátricos) e a expressão do miR-103, miR-107 e miR-497 em 82 tumores (59 adultos e 23 pediátricos). O sequenciamento dos genes DICER1 e TARBP2 foi realizado em um subgrupo quase idêntico de 83 tumores. RESULTADOS: Em adultos, uma expressão forte para a DICER1 foi encontrada em 24 de 75 adenomas (32%) e em 39 de 79 carcinomas (51%; X2= 4,8, p= 0,028). Similarmente, a hiperexpressão do gene DICER1 foi encontrada em 15 de 25 carcinomas (60%) e em 7 de 30 adenomas (23%; X2= 7,64, p= 0,006). Dentre os carcinomas de adultos, a imunorreatividade fraca para DICER1 foi significativamente mais frequente em carcinomas metastáticos do que em não metastáticos (66% vs. 31%; X2= 9,3, p= 0,002). Além de mais agressivos, os carcinomas com uma expressão fraca da DICER1 foram diagnosticados em pacientes com uma mediana de idade menor (35 vs. 45 anos, p= 0,02), maior tamanho (12,3 vs. 9 cm, p= 0,001), estadio mais avançado (ENSAT 3 ou 4 em 55% vs. 30%, p= 0,04) e maior escore de Weiss (6 vs. 4, p= 0,02). Adicionalmente, a expressão fraca para a DICER1 se correlacionou com uma significativa redução da sobrevida global (p= 0,004) e livre de doença (p= 0,005). Na análise multivariada, Ki67 >- 10% (p= 0,0001) e expressão proteica fraca para DICER1 (p= 0,048) permaneceram como marcadores significativos de recorrência. No grupo pediátrico, a expressão gênica e proteica da DICER1 não foi diferente entre tumores clinicamente malignos e benignos Não identificamos nenhuma variante genética nos quatro sítios de metais do domínio RNAse IIIb do gene DICER1 tanto em adultos como em crianças. Além disso, a expressão proteica e gênica da DICER1 não se correlacionou com a expressão do miR-103 e miR-107. O miR-107 foi hiperexpresso em carcinomas em relação a adenomas de adultos, mas não apresentou impacto na análise de sobrevida. Em relação ao gene TARBP2, a sua expressão gênica e proteica não teve correlação com parâmetros histopatológicos e clínicos em adultos e crianças. Variantes genéticas no sequenciamento do éxon 5 do gene TARBP2 não foram encontradas nesses tumores. Além disso, o miR-497 não foi expresso em nenhum dos tumores da nossa coorte. CONCLUSÕES: A baixa expressão proteica da DICER1 foi um marcador de prognóstico em pacientes adultos com carcinoma cortical da suprarrenal. A perda da expressão da DICER1 em carcinomas metastáticos não foi causada por mutações inativadoras no domínio RNase IIIb do gene DICER1 e nem por alteração na expressão do miR-103 e miR-107, reguladores da sua expressão em outros tecidos. Apesar do miR-107 ter sido hiperexpresso em carcinomas, a sua expressão não teve importância prognóstica. Por fim, a expressão do gene TARBP2 e da proteína TRBP não apresentou importância prognóstica nos tumores do córtex da suprarrenalINTRODUCTION: Adrenocortical cancer is a rare neoplasia with an estimated incidence of 0.5-2.0/million/year in adults. There are currently few therapeutic options for patients with adrenocortical cancer, and new insights into the pathogenesis of this lethal disease are needed. The microRNA (miRNA) expression profile of human tumors has been characterized by an overall miRNA downregulation. DICER1 enzyme and its cofactor TRBP are a key component of the miRNA processing machinery. It was recently demonstrated that escaping miRNA control in cancer cells due to Dicer downregulation may allow the phenotypic emergence of more aggressive genetic variants, accelerating cancer progression. Recently, DICER1 mutations in the RNase IIIb domain were found in 29% of nonepithelial ovarian tumors, predominantly in Sertoli-Leydig cell tumors (60%). In addition, TARBP2 truncating mutations, causing DICER1 destabilization, were identified in tumor cell lines with microsatellite instability. AIM: To study the mRNA and protein expression of DICER1 and TRBP in adult and pediatric adrenocortical tumors; To investigate DICER1 mutations in metal biding sites located at the RNase IIIb domain; To investigate inactivating mutations in the exon 5 of TARBP2 gene; To determine the expression of miR-103 and miR-107, DICER1 regulators, and miR-497, a TRBP regulator. METHODS: Protein expression of DICER1 and TRBP was evaluated by immunohistochemistry in a tissue microarray with 198 adrenocortical tumors [154 in adults (75 adenomas and 79 carcinomas) and 44 in children (38 clinically benign and 6 malignant)]. Expression of DICER1 and TARBP2 genes was assessed in a subgroup of 84 tumors (61 adults and 23 children) and miRNA expression in 82 tumors (59 adults and 23 children). The DICER1 and TARBP2 gene sequencing was performed in a subgroup of 83 tumors. RESULTS: In adults, a strong DICER1 expression was demonstrated in 39 out of 79 carcinomas (51%) and in 24 out of 75 adenomas (32% X2= 4.8, p= 0.028). Similarly, DICER1 gene overexpression was demonstrated in 15 out of 25 carcinomas (60%) and in 7 out of 30 adenomas (23%; X2= 7.64, p= 0.006). Among adult adrenocortical carcinomas, a weak DICER1 expression was significantly more frequent in metastatic than in non-metastatic adrenocortical carcinomas (66% vs. 31%; X2= 9.3, p= 0.002). Besides being more aggressive, adult adrenocortical carcinomas with a weak DICER expression were diagnosed in younger patients (median 35 vs. 45 yrs, p= 0.02) and had larger size (12.3 vs. 9 cm, p= 0.001), more advanced staging (ENSAT 3 or 4 in 55% vs. 30%, p= 0.04) and higher Weiss score (6 vs. 4, p= 0.02). Additionally, a weak DICER1 expression was significantly correlated with a reduced overall (p= 0.004) and disease-free (p= 0.005) survival. In the multivariate analysis, Ki67 >- 10% (p= 0.0001) and a weak DICER1 expression (p= 0.048) remained as independent predictors of recurrence. In the pediatric group, DICER protein and gene expression was not different between clinically benign and malignant tumors. No variant was identified in the metal binding sites of the RNase IIIb domain of DICER1 gene in both adult and pediatric tumors. Furthermore, DICER1 protein and gene expression did not correlate with miR-103 e miR-107 expression. miR-107 was overexpressed in adult carcinomas compared to adenomas, but it was not a predictor of poor outcome. Regarding TARBP2 gene, its gene and protein expression did not correlate with histopathological and clinical parameters in both children and adults. No variant was identified in exon 5 TARBP2 gene. Additionally, miR-497 was not expressed neither in the normal adrenal cortex and in adrenocortical tumors. CONCLUSION: A weak DICER1 protein expression was significantly associated with poor outcome in adult adrenocortical carcinomas. However, DICER1 deregulation in adult ACCs was not caused by mutations within the RNase IIIb domain and not associated with expression of its regulatory miRNAs. Although miR-107 was overexpressed in adult adrenocortical carcinomas, its expression was not correlated with a reduced survival. Finally, TARBP2 gene and protein expression was not associated with poor outcome in adrenocortical tumor