Development of production process and characterization of periplasmic interferon-α2a expressed in Escherichia Coli

Os IFN-&alpha;2 são atualmente utilizados em terapia de hepatite B e C, leucemia, mieloma múltiplo, leucemia de células pilosas, melanoma, sarcoma de Kaposi, linfoma folicular e carcinoma de células renais, em associação ou não com outras drogas. Este trabalho descreve um processo de produção, purificação e caracterização de interferon-&alpha;2a secretado para o espaço periplasmico de E. coli utilizando um vetor baseado no uso constitutivo do promotor lambda PL. Foi validada também uma análise em cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) para monitoração do processo. Dessa forma, este trabalho descreve inicialmente um método de RP-HPLC para análise qualitativa e quantitativa de interferon-&alpha;2a e interferon-&alpha;2b. O método foi desenvolvido e validado quanto à recuperação, precisão, linearidade, sensibilidade e especificidade. O teste de recuperação indicou erro menor que 1 % e as determinações quantitativas intra-dia e inter-dia apresentaram desvio padrão relativo sempre menores que 4 %, enquanto a sensibilidade experimental foi de 0,3 &mu;g (RSD = 5 %). Em relação à linearidade, o coeficiente de correlação assumiu o valor de 0,998 (p<0,0001), para o intervalo de massa analisada de 0,62 a 10 &mu;g de interferon. Essa metodologia permite a aplicação de RP-HPLC como uma ferramenta poderosa para monitoração de níveis de expressão e qualidade do interferon-&alpha;2 durante ou logo após a fermentação. A temperatura ótima de expressão foi avaliada nos intervalos de 30 a 42 °C, em cultivo em erlenmeyer. As produções volumétrica e específica foram maiores para temperaturas iguais ou superiores a 35 °C. Dessa forma, considerando a potencial degradação da proteína recombinante induzida pela temperatura, a temperatura ótima para a expressão de interferon neste processo foi definida como 35 °C. Os maiores valores de produção específica e volumétrica obtidos, em produção em erlenmeyer, foram 1,04 &mu;g/mL/A600 e 3,45 mg/L, respectivamente. Foi padronizado um método de purificação laboratorial, em duas etapas: uma cromatografia de troca iônica, seguida de uma etapa de cromatografia de exclusão molecular. A pureza final e a recuperação em massa foram de, respectivamente, 95,3 % e 66 %. O produto final também foi caracterizado por meio de análise em SDS-PAGE, western blotting, espectrometria de massas, HPLC de exclusão molecular e HPLC em fase reversa.IFN-&alpha;2 is currently utilized in hepatitis B and C, leukemia, multiple myeloma, hairy cell leukemia, melanoma, Kaposi\'s sarcoma, follicular lymphoma, and renal cell carcinoma therapy, with or without other drugs. In this work, a process for E. coli periplasmic interferon-&alpha;2a production and purification utilizing a lambda PL promoter based on constitutive expression was proposed. As a tool for production monitoring, reversedphase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis directly from periplasmic extract was validated. Thus, initially it was described a RP-HPLC methodology for qualitative and quantitative analysis of recombinant human interferon-&alpha;2a and interferon-&alpha;2b. The method has been set up and validated for accuracy, precision, linearity, sensitivity and specificity. A recovery test indicated a bias of less than 1% and intra-day and inter-day quantitative determinations presented relative standard deviations always < 4 %, while experimental sensitivity was 0.3 &mu;g (RSD = 5 %). Regarding to linearity, the coefficient of determination was 0.998 (p