Mutations induced by a chemical in strains of Escherichia coli to the attenuation and vaccine development against avian colibacillosis

A colibacilose aviária caracteriza-se como uma infecção extra-intestinal secundária a outros agentes. É responsável por grandes perdas econômicas na criação de aves comerciais, sendo sua prevenção fundamental para minimizar prejuízos. O objetivo deste estudo foi atenuar cepas virulentas de Escherichia coli aviárias, por indução de mutagênese química. Foram selecionadas nove (09) cepas pertencentes à coleção de cultura do Laboratório de Ornitopatologia da FMVZ-USP. Todas as cepas estudadas foram resistentes à eritromicina, lincomicina, oxaciclina, penicilina, tiamulina e tilmicosin e sensíveis ao ácido nalidíxico, cloranfenicol, ciprofloxacina, colistina, enrofloxacina, florfenicol e gentamicina. Ocorreram resistências nas amostras analisadas de 33,33%, 22,22%, 11,11%, 55,55%, 66,66%, 77,77%, 33,33%, 22,22%, 22,22% e 33,33%, respectivamente, a amoxacilina, a ampicilina, a doxaciclina, a espectiomicina, a estreptomicina, a lincomicina-espectiomicina, a neomicina, a rifampicina, a tetraciclina e ao trimetropin-sulfa. Induziu-se resistência a estreptomicina ou rifampicina ou ácido nalidíxico como marcadores. Não houve o desenvolvimento de resistências a outros antimicrobianos testados, após a exposição a substância mutagênica. Os resultados da amplificação dos genes por PCR, mostraram que todas as cepas foram negativas para papC, cnf e astA e todas foram positivas para iuc e irp2. Duas cepas foram positivas para os genes vat, cinco para iss, quatro para o gene tsh, uma para cvi/cva, duas para sfaI e uma para astA. Após o uso da substância mutagênica duas cepas apresentaram reações negativas para os genes tsh, cvi/cva e sfaI e uma cepa para o gene astA. No teste de AFLP verificaram-se diferenças em similaridade de bandas em oito (08) das nove (09) cepas, quando comparadas com a amostra tratada com a substância mutagênica, sendo que este indice variou de 40% a 96,3%. Embora no teste de patogenicidade em pintinhos de um dia de idade não tenha ocorrido diferenças significativas na mortalidade nos diferentes grupos estudados, houve alteração de patogenicidade em cinco cepas expostas à substância mutagênica. Ocorreram reduções significativas em relação ao escore de lesões quando os grupos foram comparados (p<0,05), indicando atenuação pela substância mutagênica.The avian colibacillosis is characterized as an extraintestinal infection which is secondary to other agents. It is responsible for considerable economic loss in the breeding of commercial birds, making its prevention essential to reducing damages. The aim of this study was to attenuate viral strains of avian Escherichia coli, using chemical mutagenesis induction. Nine (09) strains were selected from the culture collection of the Ornitopathology Laboratory of the School of Veterinary Medicine of the University of São Paulo. All analyzed strains were resistant to erythromycin, lincomicin, oxacillin, penicillin, tiamulin and tilmicosin and they were sensitive to nalidixic acid, chloramphenicol, ciprofloxacin, colistin, enrofloxacin, florfenicol and gentamicin. The analyzed samples presented the following resistance levels: 33.33%, 22.22%, 11.11%, 55.55%, 66.66%, 77.77%, 33.33%, 22.22%, 22.22% and 33.33% to, respectively, amoxicillin, ampicillin, doxycycline, spectinomycin, streptomycin, lincomycin-spectinomycin, neomycin, rifampicin, tetracycline and trimethoprim-sulfa. The resistance to streptomycin or rifampicin or nalidixic acid was induced as a marker. There was no development of resistance to other tested antimicrobials after the exposure to the mutagenic substance. The results of the PCR gene amplification showed that all strains were negative for papC, cnf and astA and they were all positive for iuc and irp2. Two strains were positive for the vat genes, five for iss, four for the tsh gene, one for cvi/cva, two for sfaI and one for astA. After using the mutagenic substance, two strains presented negative reactions for the tsh, cvi/cva and sfaI genes and one strain for the astA gene. In the AFLP test, differences were found for band similarity in eight (08) out of nine (09) strains, when compared with the samples treated with the mutagenic substance and this rate varied from 40% to 96.3%. Although the pathogenicity test in one-day-old chicks did not present significant differences in the mortality rate in the different analyzed groups, there was a pathogenicity alteration in five strains exposed to the mutagenic substance. There were significant reductions regarding the lesion scores when the groups were compared (p