Structural and functional studies of beta-galactosidases enzymes from bacteria

As β-galactosidases são dissacaridases capazes de realizar a reação de hidrólise das ligações β(1→4) de um galactosídeo, tendo a lactose como principal substrato natural. Essas enzimas são amplamente utilizadas na ciência e na indústria, apresentando um alto potencial biotecnológico. Além das propriedades hidrolíticas, as β-galactosidases possuem a característica de sintetizar açúcares complexos chamados galactooligossacarídeos, que são conhecidos como prebióticos. Nesse projeto, nos propusemos a estudar enzimas do tipo β-galactosidase com alto potencial biotecnológico. Foram escolhidos genes dos organismos Xanthomonas campestris pv. campestris e Bifidumbacterium bifidum, os quais possuem alta atividade β-galactosídica, conforme a literatura. Foram clonados nove genes, dos quais o produto de quatro foram purificados, cristalizados e tiveram sua estrutura cristalográfica determinada. A enzimas BbgII foi resolvida pela técnica de single anomalous diffraction. Sua estrutura revelou um trímero em forma de barril, no qual foi possível observar interações entre os resíduos do sítio ativo e a galactose. Adicionalmente, realizamos a caracterização bioquímica e cinética da enzima nativa e de mutantes pontuais. Também foram resolvidas as estruturas cristalográficas das enzimas XCC_1754, XCC_2404 e XCC_2895. A enzima XCC_1754 exibiu uma significativa alteração no loop 11 nas cadeias entre os dois monômeros da unidade assimétrica. Esse loop exibe as conformações aberta e fechada sobre o sítio de interação com os substratos e, através de ensaios de mutação, propomos que essas diferenças são mediadas pelas glicinas 294 e 302, que atuam como uma dobradiça. Apesar de apresentar menor afinidade pelo substrato, o mutante G294P exibiu uma atividade 50% maior do que a enzima nativa. Enquanto isso, o mutante G302P, apesar de exibir um ganho em sua afinidade, perdeu a capacidade de processar eficientemente o substrato. A enzima XCC_2895 também possui três domínios, porém características bioquímicas similares a XCC_1754. Apesar de haver ainda a necessidade de mais estudos para podermos comparar ambas, acreditamos que o fato da enzima XCC_2404 possuir uma estabilidade térmica mais elevada que a enzima XCC_1754, pode estar relacionado com a formação de grandes oligômeros.The β-galactosidases are glycosyl hydrolases that act at the β(1→4) bonds from galactosides, with lactose as the main natural substrate. The use of such enzymes in both science and industry is very common, due its high biotechnological applicability. Beside its hydrolytic capacity, the β-galactosidases are also commonly used for the synthesis of galactoligossacharydes, well-known prebiotics. The focus of this project was to study β-galactosidases with high biotechnological potential. For that, genes from the organisms Xanthomonas campestris pv. campestris, e Bifidumbacterium bifidum were selected due the high β-galactosidic activity of those organisms, according previous works. Such genes were cloned, and four of them were expressed, crystalized and had its x-ray structure determined. The enzyme BbgII was solved applying the single anomalous diffraction method. Its structure shows a trimer forming a barrel, in which it was also possible to observe interactions between residues of the active site and galactose. The native and site direct mutants were biochemically characterized, revealing important features and the different roles of amino acids of active site. We also solved the structure of the enzymes XCC_1754, XCC_2404 and XCC_2895. The enzyme XCC_1754 showed a significant difference between the loop 11 of the two monomers at the asymmetric unit. This loop presented both open and closed conformations, which we believe it was caused by glycines 294 and 302, acting as a hinge. Despite the mutant G294P exhibited a decrease in enzyme affinity for the substrate, its general activity increased up to 50%. Meanwhile, the mutant G302P has gain affinity for the substrates, but it fails into process the substrate efficiently. The enzyme XCC_2895 shows three domains, but its biochemical properties are similar to the enzyme XCC_1754. Although there is still a need for further studies to be able to compare the enzymes, we believe that the higher thermal stability of XCC_2404 compared to XCC_1754 could be related to the formation of large oligomers