Molecular characterization of isolates of Sarcocystis spp. obtained from feces of opossums of the genus Didelphis by analysis of genes coding for surface antigens

O objetivo deste trabalho foi desenhar primers, amplificar fragmentos de três loci que codificam antígenos de superfície de protozoários do gênero Sarcocystis spp. isolados do intestino de marsupiais do gênero Didelphis spp., sequenciar os fragmentos gênicos de todos isolados e compará-los entre si e com fragmentos de sequências homólogas disponíveis no GenBank. Trinta e duas amostras de Sarcocystis spp. de gambás do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil, tiveram o DNA extraído e amplificado utilizando marcadores moleculares em genes codificadores de antígeno de superfície (SAG-2, SAG-3, e SAG-4). Entre essas amostras, 28 tiveram pelo menos um dos fragmentos gênicos sequenciados. Foi possível sequenciar os 3 fragmentos gênicos de 20 amostras. As análises das sequências dos genes renderam os seguintes resultados: SAG-2: 275 nucleotídeos e sete alelos para 26 amostras; SAG-3: 353 nucleotídeos e seis alelos para 21 amostras; SAG-4: 278 nucleotídeos e onze alelos para 25 amostras. Para cada marcador, análises filogenéticas foram realizadas empregando métodos de distância. As reconstruções filogenéticas permitiram verificar as relações de ancestralidade entre os diferentes alelos, que foram nomeados de acordo com o critério de evolução inferido na topologia das árvores. Para os três loci, diferentes alelos foram agrupados em três grupos ou genótipos, que foram nomeados com caracteres em números romanos I, II, III e IV. Diferenças intra-genótipo (sub-genótipos) foram representados por letras minúsculas (Ia, Ib, Ic, etc.). Cada alelo foi nomeado com numeração arábica (Ia1, Ia2, Ia3, etc.). Nas analises filogenéticas concatenadas baseada em dados de aminoácidos foi possível dividir as amostras dentro de três grupos. A filogenia baseada nas sequências de aminoácidos indica que três grupos de organismos devem existir dentro do complexo de indivíduos da população estudada (Sarcocystis-RS, Falcatula-like e Neurona-like). Embora o grupo designado como Sarcocystis-RS tenha um único alelo para o locus gênico SAG-3 (configuração do tipo III), táxons deste grupo compartilham alelos com indivíduos do grupo Falcatula-like. Assim, seria plausível assumir que exista uma troca gênica entre as duas populações. No que diz respeito ao grupo Neurona-like, nenhum dos indivíduos deste grupo compartilham alelos com indivíduos de outros grupos. No entanto, esta observação precisa ser confirmada, pois as análises foram baseadas em poucas sequências Neurona-like (duas sequências). Este relato revela uma notável diversidade genética entre os isolados de Sarcocystis spp de gambás do Brasil.The present work aimed to design primers and amplify fragments of three loci that code for surface antigens of the protozoan genus Sarcocystis spp. isolated from intestine of marsupials of the genus Didelphis spp and to sequence the gene fragments of all isolates and compare them with each other and with fragments of homologous sequences available in GenBank. Thirty two samples of Sarcocystis spp. from opossums from the State of Rio Grande do Sul, had the nuclear DNA extracted and amplified using the molecular markers targeted to genes encoding surface antigens (SAG-2, SAG-3, and SAG-4). Among these samples, 28 had at least one of the gene fragments sequenced. It was possible to sequence the three gene fragments from 20 samples. The analysis of gene sequences yielded the following results: SAG-2: 275 nucleotides and seven alleles for 26 samples; SAG-3: 353 nucleotides and six alleles for 21 samples; SAG-4: 278 nucleotides and eleven alleles for 25 samples. For each marker phylogenetic analysis was performed employing distance methods. The phylogenetic reconstructions allowed us to verify the ancestry relationships between different alleles, which were named according to the criteria of evolution inferred from the tree topology. For the three loci, different alleles were grouped into three groups or genotypes, which were named with characters in Roman numerals I, II, III and IV. Intra-genotype differences (sub-genotypes) were represented by lowercase letters (Ia, Ib, Ic, etc.). Each allele was named with Arabic numerals (Ia1, Ia2, Ia3, etc.). With concatenated phylogenetic analysis based on amino acid dataset it was possible to divide the samples into three groups. The amino acid based phylogeny indicates that three groups of organisms must exist within the complex of individuals in the population studied (Sarcocystis-RS, Falcatula-like, and Neurona-like). Although the group designated as Sarcocystis-RS has a unique allele for the genetic locus SAG-3 (configuration type III), the taxa of this group share alleles with individuals in the Falcatula-like. Thus, it is plausible to assume that gene exchange occurs between these two populations. Regarding the Neurona-like group, none of the individuals in this group share alleles with individuals of the other groups. However, this observation remains to be confirmed, because this analysis was based on very few Neurona-like sequences (two sequences). This report reveals a striking genetic diversity among Sarcocystis spp isolated from opossums from Brazil