Ornithodoros brasiliensis: morphological studies of larva and adults, life cycle in laboratory conditions, and investigation and diagnosis of Rickettsia spp

Ornithodoros brasiliensis Aragão é um carrapato endêmico do Brasil, restrito às regiões serranas e frias do estado do Rio Grande do Sul. É uma espécie bastante agressiva aos humanos, causando febre, muita dor e intensa resposta inflamatória no local da picada. O ciclo biológico de O. brasiliensis (ovo a adulto, única geração) realizado nos anos 50, utilizando ratos brancos como hospedeiros, levou um total de 103 e 184 dias de amplitude, com máximo de 7 ínstares ninfais observados e com emergência de adultos a partir de N4, estando os machos em maior proporção. Os hospedeiros apresentaram febre e uma bactéria espiroqueta denominada Borrelia brasiliensis foi descrita de esfregaços sanguíneos desses animais. Porém as borrélias não puderam ser cultivadas por muito tempo, e acabaram desaparecendo. Houve um silêncio de mais de 50 anos sobre relatos de ocorrência de O. brasiliensis, deixando inclusive dúvidas se a espécie estava extinta de fato. No entanto, há cerca de quatro anos, alguns espécimes de carrapatos da mesma localidade foram coletados e identificados como O. brasiliensis. O presente trabalho teve por objetivos estudar a morfologia e a biologia de O. brasiliensis, em condições de laboratório, bem como investigar a presença de bactérias do gênero Rickettsia em espécimes coletados. Ninfas e adultos foram alimentados em cobaias de laboratório e as fêmeas acasaladas realizaram posturas que resultaram nas gerações sucessivas. A larva e os adultos foram descritos e redescritos, e comparados com as espécies próximas, O. rostratus e O. turicata. Análises moleculares de uma porção do gene 16S rDNA mitocondrial foram comparadas com as sequências depositadas no GenBank e apresentaram valores de máximo bootstrap de 100% para ambas, O. rostratus e O. turicata. O ciclo biológico completo (ovo a ovo) de O. brasiliensis foi obtido entre 215,4 e 195 dias, em média, para duas gerações consecutivas, respectivamente. Os períodos médios de pré-oviposição, oviposição e incubação dos ovos (em dias), para a geração F1 foram 76,7 ± 27,01 (31-117); 15,55 ± 5,36 (10-24); 10,6 ± 4,5 (3-19) e para geração F2 foram 54,1 ± 8,7 (40-65), 15,8 ± 8,9 (7-36); 15,4. Os períodos médios de pré-ecdise larval foram de 12,5 ± 1,8 (10-15), considerando as duas gerações. A larva não se alimenta, enquanto que há um repasto sanguíneo para cada instar ninfal, antes de cada muda. Um total de 5 instares ninfais foi observado, sendo que os períodos médios de préecdise para os instares N1, N2, N3, N4 e N5, respectivamente para as duas gerações foram de 33,3 ± 4 (32-45), 38,6 ± 2,5 (36-47), 31,1 ± 3,4 (28-42), 34,8 ± 3,3 (31-43), 37,2 ± 2,4 (35-41) e 32,5 ± 3,3 (29-40), 37,5 ± 2,5 (34-44), 34,6 ± 3,2 (31- 37), 36,5 ± 2,5 (34-42), 32,5 ± 0,7 (32-33). Os períodos médios de alimentação para os ínstares ninfais, foram semelhantes nas duas gerações, sendo de 28,62 ± 3,67 (25,2 35,1) minutos. Adultos alimentam-se repetidas vezes, e as posturas sempre são precedidas de repasto sanguíneo, embora somente dois ciclos gonotróficos foram observados. O primeiro ciclo gonotrófico apresentou maior número de ovos depositados, com 139 ± 13,8 (53 197) em relação ao segundo 73,8 ± 10,6 (53 123). A investigação da presença de riquétsia foi avaliada em 107 espécimes recentemente coletados, evidenciando um total de 12 exemplares positivos. O produto amplificado pela PCR foi sequenciado e as análises moleculares apresentaram homologia de 98% com sequências disponibilizadas no Genbank, correspondentes a uma espécie asiática denominada RDa420 (AF497584) e outra brasileira, Rickettsia bellii (DQ865204) .Ornithodoros brasiliensis Aragão is an endemic tick to Brazil, restricted to the highlands and cold regions of the state of Rio Grande do Sul. This species is very aggressive to humans, causing fever, great pain and intense inflammatory response at the site of the bite. The life cycle of O. brasiliensis (egg to adult, single generation) previously performed (studied during 50\') using white mice as host, spent a total of 103 and 184 days of amplitude, with maximum 7 nymphal instars observed, with adult emerging from N4, and males in greater proportion. The hosts had fever and spirochete bacteria called Borrelia brasiliensis was described from blood of the animals used. Nevertheless borrelias could not be cultivated for a long time, and they eventually disappeared. A silence of more than 50 years on reports of occurrence of O. brasiliensis, left doubts about whether the species was extinct. However, about four years ago, some specimens of ticks were collected in the same locality and identified as O. brasiliensis. This work aimed to study the morphology and biology of O. brasiliensis, under laboratory conditions, and investigate the presence of bacteria of the genus Rickettsia in the collected ticks. Nymphs and adults were fed on laboratory guinea pigs, and mated females laid eggs that resulted in the successive generations. The larvae and adults have been described and redescribed, respectively, and compared with the closely related species, O. rostratus and O. turicata. Molecular analyzes of a portion of the mitochondrial 16S rDNA gene was compared with the sequences deposited in GenBank, showing maximum bootstrap values out of 100% for both O. rostratus and O. turicata. In this study, the complete life cycle (egg to egg) of O. brasiliensis was obtained between 215,4 and 195 days, on average, for the two generations studied, respectively. The average periods of preoviposition, oviposition and incubation of the eggs to the F1 generation were 76,7 ± 27,01 (31-117), 15,55 ± 5,36 (10-24), and to F2 were 54,1 ± 8,7 (40-65), 15,8 ± 8,9 (7-36). The averaging periods to the preecdysis of the larvae were 12,5 ± 1,8 (10-15), considering the two generations. The larva does not feed, while for the nymphs there is a blood meal for each instar, before each molt. A total of five nymphal instars was observed, and the average periods of pre-molt instars for N1, N2, N3, N4 and N5, for two generations, respectively, were 33,3 ± 4 (32-45), 38,6 ± 2,5 (36-47), 31,1 ± 3,4 (28-42), 34,8 ± 3,3 (31-43), 37,2 ± 2,4 (35-41) and 32,5 ± 3,3 (29-40), 37,5 ± 2,5 (34- 44), 34,6 ± 3,2 (31-37), 36,5 ± 2,5 (34-42), 32,5 ± 0,7 (32-33). The average feeding time of nymphal instars, were similar in the two generations, being 28,62 ± 3,67 (25,2 35,1) minutes. Adults fed repeatedly, and the postures were always preceded by blood meal, although only two gonotrophic cycles have been observed. The first gonotrophic cycle presented higher average number of eggs deposited 139 ± 13,8 (53-197) that the second 73,8 ± 10,6 (53 123). The investigation to the presence of rickettsia was performed in 109 recently collected ticks, showing a total of 12 positive specimens. The amplified PCR product was sequenced and molecular analyzes showed 98% homology with sequences available in Genbank, corresponding to an Asian species named RDa420 (AF497584) e another Brazilian strain named Rickettsia bellii (DQ865204)