Influence of mitochondrial depletion and suplementation in embryonic apoptosis

Estudos realizados com zigotos bovinos submetidos a uma diminuição de cerca de 50% do conteúdo mitocondrial não apresentaram efeito deletério ao desenvolvimento embrionário in vitro. Este modelo foi desenvolvido pela centrifugação de zigotos após a fecundação in vitro (FIV), retirada do extrato citoplasmático rico em mitocôndrias (ECRM) e posterior introdução de 20-30% de ooplasto (FERREIRA, 2006). Sabendo-se que esse modelo biológico permite o desenvolvimento embrionário em condição de depleção mitocondrial, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da remoção e da suplementação mitocondrial em estádio de zigoto visando compreender a importância da organela no processo de desenvolvimento e morte celular programada (MCP). Este trabalho descreve a transferência de mitocôndrias entre zigotos bovinos. Para tanto, foi desenvolvido um sistema de reconstrução de embriões bovinos capaz de gerar indivíduos depletados e suplementados de mitocôndrias. O extrato citoplasmático rico em mitocôndrias (ECRM) dos zigotos centrifugados foi retirado do oócito doador, para gerar um zigoto depletado (D). Posteriormente, foi retirado um volume citoplasmático de aproximadamente 7,1% para gerar um embrião receptor. Com a quantidade retirada do zigoto depletado (doadores), foi realizada a suplementação de zigotos biopsados (receptores), formando assim, o grupo suplementado (S). A depleção mitocondrial causou uma diminuição na quantidade de DNAmt que foi recuperada antes das 72 horas de cultivo possivelmente, devido a um aumento na expressão de mtTFA. Os genes anti-apoptóticos BCL2 e PI3K tiveram sua expressão aumentada nos embriões depletados. A suplementação e depleção mitocondrial resultaram em uma diminuição na taxa de desenvolvimento embrionário até o estádio de 8 células e na formação de blastocistos. A técnica suplementação mitocondrial por meio de micromanipulação não apresentou efeito sobre a quantidade de DNAmt e atividade mitocondrial estimada pelo potencial de membrana interna mitocondrial (Ψmm), apresentando um aumento no Ψmm apenas às 168 horas em conseqüência do aumento da expressão de COXI e mtTFA. A suplementação e a depleção geraram efeitos negativos na quantidade de núcleos totais e os embriões suplementados apresentaram uma maior taxa de fragmentação de núcleos provavelmente, por um desbalanço de fatores pró e anti-apoptóticos.Studies developed with bovine zygotes submitted to a decrease of about 50% of the mitochondrial content did not present a deleterious effect on in vitro embryonic development. This model was developed by the centrifugation of zygotes after in vitro fertilization (IVF), removal of the mitochondria enriched cytoplast fraction (MECF) and posterior introduction of 20-30% ooplast (FERREIRA, 2006). Knowing that this biological model allows the development of embryos with mitochondrial depletion, the objective of this study was to evaluate the effect of the mitochondrial removal and supplementation in zygotes aiming to understand the organelle importance in the development and programmed cellular death process (PCD). Therefore, we developed a reconstruction model capable to generate mitochondrial depleted and supplemented embryos. The MECF of the centrifuged zygotes was removed from the donor\'s oocyte (depleted group-D). To prepare the supplemented group (S), a biopsy of approximately 7.1% of the cytoplasm was removed from the recipient zygote for the supplementation with MECF derived from the donor. Mitochondrial depletion caused a decrease of DNAmt amount that was replenished before 72 hours possibly due to an increase of mtTFA, BCL2 and PI3K expression and no effects in Ψmm. The technique of mitochondrial supplementation by micromanipulation showed no effect on the mitochondria DNA amount and activity estimated by mitochondrial membrane potential (Ψmm). The Ψmm increased at 168ha in consequence of an increase in COXI and mtTFA expression. Mitochondrial depletion and supplementation caused a decrease in embryonic development in the 8-cells stage, on blastocyst production and total cell number. The supplementation resulted in increased rates of fragmented nuclei possibly due to an imbalance between pro- and anti-apoptotic factors