Genetic transformation of sweet orange and Micro-Tom tomato with Citrus sinensis npr1 and npr3-4 genes

A cultura da laranja doce é muito importante ao redor do mundo, em especial no Brasil, maior produtor mundial dessas frutas. A produção citrícola sempre esteve ameaçada por muitas doenças de grande importância, tais como, o cancro cítrico, a clorose variegada dos citros (CVC) e pinta preta. Entretanto, em 2004, surgiu o huanglongbing (HLB) ou greening, que tem devastado pomares, e para a qual ainda não foi encontrada uma solução definitiva. A transgenia pode ser uma técnica auxiliar no manejo desta doença com a busca de cultivares mais tolerantes, em especial ao HLB. Neste trabalho, as pesquisas de transgenia não envolveram genes exógenos à planta como, por exemplo, genes de outros organismos ou genes sintéticos, ou seja, foi baseado em tecnologias mais recentes já aplicadas em outras espécies vegetais, nas quais a transgenia é utilizada para super-expressar genes dos sistemas de defesa da própria planta. Estudos indicam que a super-expressão de genes do sistema de Resistência Sistêmica Adquirida (SAR - do inglês, \"Systemic Acquired Resistance\") promove a resistência de plantas a doenças. Um gene importante para esse sistema é o gene npr1 que controla a expressão das proteínas relacionadas à patogênese (PR), em especial a PR1. Junto do gene npr1, os genes npr3 e npr4 também são reguladores desse sistema, atuando sobre o gene npr1 de acordo com os níveis de ácido salicílico presentes na célula, nível este que varia de acordo com o nível de infecção de cada célula. Porém, a avaliação de um evento transgênico de citros pode levar muitos anos. Desta forma, para diminuir esse tempo de avaliação, pensou-se em usar plantas modelos. O sistema escolhido foi o tomateiro Micro-Tom (Solanun lycopersicum L. cv. Micro-Tom). Para a obtenção das construções gênicas, foram identificados os genes Csnpr1, Csnpr3 e Csnpr4 de Citrus sinensis L. Osbeck a partir dos genes Atnpr1, Atnpr3 e Atnpr4 de Arabidopsis thaliana L.. Os genes de citros foram obtidos a partir de uma planta de laranja doce por RT-PCR e clonados no vetor pCambia 2201, que foi então inserido em Agrobacterium tumefaciens para a transformação genética. Foi feita a transformação genética de plantas de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) e do tomateiro Micro-Tom. Após o crescimento dos brotos regenerados, foi feita a avaliação das plantas obtidas por meio de PCR. As plantas geneticamente modificadas foram aclimatizadas. As plantas de citros foram enxertadas e mantidas em casa de vegetação. As plantas de tomateiro Micro-Tom foram propagadas por sementes. A progênie foi avaliada aplicando o antibiótico de seleção canamicina, obtendo-se assim uma linhagem transgênica homozigota.The sweet orange industry is very important worldwide, specially in Brazil, considered the world´s largest producer. The citrus production has always been threatened by several diseases of great importance, such as canker, CVC, and black spot. However, in 2004, the huanglongbing (HLB) or greening has been detected and devastated many citrus groves, and no definitive solution has been found yet. Transgenes may be a helpful tool for the management of this diseases, leading to the production of tolerant cultivars, especially to HLB. In this work, research on transgenic did not include the use of exogenous genes to the plant, such as genes from other organism or synthetic genes, i.e, it was based on new emerging technologies, already used on other crops, in which transgeny is used to super express genes from the plants own defense system. Studies indicate that a super expression of genes from the system called Systemic Acquired Resistance (SAR) promotes disease resistance. One important gene to this system is the npr1 gene, which controls the expression of the pathogen related proteins (PR), in special the PR1. Together with the npr1 gene, the genes npr3 and npr4 are also regulators of this system, regulating the action of the npr1 gene according to the levels of salicylic acid present in the cell, this level varies with the level of infection in each cell. Nevertheless, evaluating a citrus transgenic event may take several years. In order to shorten this time, model plants were used. The model chosen was the Micro-Tom tomato (Solanun lycopersicum L. cv. Micro-Tom). In order to obtain the genetic constructions, the genes Csnpr1, Csnpr3 e Csnpr4 were identified in Citrus sinensis L. Osbeck from the genes, Atnpr1, Atnpr3 and Atnpr4 present in the Arabidopsis thaliana L. genome. The citrus genes were obtained from the citrus genome using RT-PCR procedure and cloned separately into the pCambia 2201 vector, which was inserted into Agrobacterium tumefaciens in order to perform the genetic transformation. Sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) and Micro-Tom plants were genetically modified. After the growth of the regenerated shoots, the evaluation of the obtained plants was done through PCR analysis. The genetically modified plants were acclimatized, the citrus plants were grafted and kept in the greenhouse, the Micro-Tom plants were propagated trough seeds and its progeny was evaluated by applying the selection antibiotic kanamycin, thus obtaining a homozygous transgenic line