Effect of fluoride on bone of mice with different genetic susceptibilities to fluorosis: a proteomic analysis

Tem sido demonstrado que fatores genéticos influenciam a resposta do osso e esmalte ao fluoreto (F), mas os mecanismos moleculares envolvidos não estão bem definidos. No presente estudo, foi empregada uma abordagem proteômica livre de marcadores para identificar e avaliar alterações na expressão de proteínas ósseas em duas linhagens de camundongos com diferentes susceptibilidades à fluorose (A/J susceptível e 129P3/J resistente). Camundongos machos das linhagens 129P3/J e A/J foram distribuídos em três grupos para cada linhagem, que receberam ração com baixa concentração de F e água de beber contendo 0, 10 e 50 ppm F por 8 semanas. A concentração de F foi analisada no plasma e fêmur. A atividade da fosfatase alcalina foi dosada no plasma. Fêmur, tíbia e vértebra lombar foram submetidos à análise por micro-CT. A taxa de aposição mineral (MAR) também foi avaliada no osso cortical dos camundongos. Em adição, eletroforese unidimensional e cromatografia líquida - espectrometria de massas sequencial (LC-ESI-MS/MS) foram utilizadas para identificar e caracterizar as proteínas de fêmur da linhagem 129P3/J. Para análise proteômica quantitativa, proteínas ósseas foram extraídas para cada grupo empregando quatro diferentes etapas: (a) tampão PBS (pH 7,4) por 24h, (b) tampão de Guanidina HCl 4 M / Tris HCl 50 mM (pH 7,4) por 96 h, (c) tampão EDTA 0,5 M / Tris HCl 50 mM (pH 7,4) por 96 h, e por último (d) tampão de Guanidina HCl 4 M / Tris HCl 50 mM (pH 7,4) por 96 h. As proteínas ósseas extraídas para cada grupo foram separadamente submetidas ao LC-ESI-MS/MS, seguido da análise semi-quantitativa de diferença de expressão proteica livre de marcadores. Foram identificadas várias proteínas ósseas com alteração na abundância entre os 3 tratamentos com F para cada linhagem e entre as duas linhagens para cada tratamento com F (razão 1,5 or 0,5, respectivamente). O F promoveu alterações na expressão de proteínas envolvidas na osteogênese e osteoclastogênese de maneira distinta para cada linhagem. Embora não tenha sido observada diferença significativa nos valores de BMD e parâmetros histomorfométricos entre os grupos tratados com F para ambas as linhagens, a taxa de aposição mineral (MAR) foi maior no grupo 129P3/J tratado com 50 ppm F comparado com os grupos controle e 10 ppm F, demonstrando que o F aumentou a formação óssea nesse grupo. Em conclusão, o tratamento com F em baixa e alta dose apresentou um efeito específico para cada linhagem, confirmando uma influência genética na resposta do osso à exposição ao F.Genetic factors have been shown to influence bone and enamel responses to fluoride (F), but the molecular mechanisms involved remain unclear. In this study, a label-free proteomics approach was employed to identify and evaluate changes in bone protein expression of two mouse strains with different susceptibilities to fluorosis (A/J a susceptible strain, 129P3/J a resistant strain). Male 129P3/J and A/J mice were assigned to three groups given low-F food and water containing 0, 10 or 50 ppmF for 8 weeks. Plasma and femur were analyzed for F levels. Plasma was also evaluated for alkaline phosphatase activity. Femurs, tibiae and lumbar vertebrae were subjected to micro-CT analysis. Mineral apposition rate (MAR) was also measured in mice cortical bone. In addition, unidimensional electrophoresis and liquid chromatography/Tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) was used to identify and characterize the femur protein profile from 129P3/J mouse strain. For quantitative proteomic analysis, bone proteins were extracted using four different steps: (a) PBS buffer (pH 7.4) for 24h, (b) 4 M Guanidine HCl/50 mM Tris HCl buffer (pH 7.4) for 96 h, (c) 0.5 M EDTA/50 mM Tris HCl buffer (pH 7.4) for 96 h, followed by (d) 4 M Guanidine HCl/50 mM Tris HCl buffer (pH 7.4) for 96 h. Bone proteins extracted from each group were separately subjected to LC-ESI-MS/MS, followed by label-free semi-quantitative differential expression analysis. Changes in many bone proteins abundance were found among the F treatment groups for each mouse strain and between the strains for each F treatment group (ratio 1.5 or 0.5, respectively). F led to alterations in expression of proteins involved in osteogenesis and osteoclatogenesis in a different way for each strain. Although F treatment had no significant effects on BMD and histomorphometric measurements for both strains, mineral apposition rate (MAR) was higher in 129P3/J mice treated with 50 ppm F compared to control and 10 ppm F groups, showing that F increased bone formation for this group. In conclusion, F treatment at low and high levels had strain specific effects in mice, confirming a genetic influence in bone response to F exposure