Silencing of genes fruitless and period: effects in locomotor and reproductive behavior of Anastrepha sp. 1 affinis fraterculus (Diptera, Tephritidae)

O complexo de espécies crípticas de Anastrepha fraterculus compreende oito morfotipos dos quais três ocorrem no Brasil. Anastrepha sp.1 aff. fraterculus é o morfotipo Brasil-1 e é uma espécie de ampla distribuição no planalto sudeste/sul do Brasil e no norte da Argentina. O comportamento reprodutivo dessa espécie é complexo, envolvendo uma série de movimentos desempenhados pelos machos para atrair as fêmeas para acasalamento, e ocorre, preferencialmente, nas primeiras horas do dia. Dois genes, period e fruitless, entre outros, são conhecidos por participar do controle do comportamento reprodutivo de vários organismos, incluindo algumas espécies de moscas-das-frutas. O presente trabalho buscou informações sobre a atuação desses genes no comportamento reprodutivo de A. sp.1, utilizando o silenciamento transitório desses genes pela metodologia de RNA interferente. Foram, primeiramente, desenhados iniciadores específicos para amplificar fragmentos do DNA genômico desses genes, sendo demonstrado que apresentaram uma similaridade entre 97 a 99% com os genes equivalentes de outras espécies de Anastrepha. A seguir, após padronização e adaptação de protocolos, foram sintetizados os RNA de dupla-fita (dsRNA) dos dois genes, que foram, então, utilizados nos experimentos de silenciamento. Análises, para verificação se os genes foram realmente silenciados foram feitas a partir a injeção dos dsRNAfru e/ou dsRNAper no abdomên de machos sexualmente maduros, tendo sido demonstrado que os genes estavam silenciados ao máximo, sete a oito dias após a injeção. Interferências no comportamento de machos sexualmente maduros, com um ou outro gene silenciado, foram avaliados por testes relacionados com dois parâmetros do comportamento reprodutivo: alterações nas atividades gerais (qualquer tipo de movimentação dos insetos) dos machos durante o ciclo circadiano (dia/noite) e mais especificamente, a atividade relacionada ao comportamento reprodutivo. Ao injetar dsRNAfru em machos adultos de A. sp.1 foi observado que não houve alteração significativa nas suas atividades gerais. Porém, foi observado que houve uma diminuição significativa no número de machos que realizavam atividades reprodutivas, sugerindo que o silenciamento de fruitless no macho adulto altera o funcionamento normal do comportamento sexual masculino. Em contrapartida, ao injetar dsRNAper em machos adultos de A. sp.1 não foi observada alteração significativa tanto nas suas atividades reprodutivas quanto nas atividades gerais. O silenciamento dos genes aparentemente não afeta a produção de espermatozóides. Apesar de controverso, esses dados corroboram com o que foi observado em D. melanogaster, em que o mutante nulo per04 não apresenta alteração significativa nos seus comportamentos em relação aos machos selavagens em um regime cíclico Dia/Noite. Dessa forma, análises adicionais serão necessárias com o objetivo de elucidar as implicações desses dois genes no comportamento locomotor e reprodutivo de Anastrepha sp.1 aff. fraterculus.The complex of cryptic species Anastrepha fraterculus comprises eight morphotypes three of which occur in Brazil. Anastrepha sp.1 aff. fraterculus correspond to the morphotype Brazil-1 and is a species of wide distribution in the southeast/south plateau of Brazil and in north of Argentina. The reproductive behavior of this species is complex, involving a series of movements performed by males to attract females for mating, and occurs in the early hours of the day. Two genes, period and fruitless, among others, are known to participate in the control of reproductive behavior of various organisms, including some species of fruit flies. The present work aimed to get information about the presumable role of these genes in the reproductive behavior of A. sp.1, using transient silencing of these genes by interfering RNA methodology. Specific primers were first designed to amplify fragments of the genomic DNA of these genes, showing they have a similarity between 97 to 99% with the equivalent genes of other Anastrepha species. After standardization and adaptation of protocols, the double-stranded RNA (dsRNA) of the two genes were synthesized, and used in the silencing experiments. Tests to verify that the genes were actually silenced, were made after injection of the dsRNAfru and/or dsRNAper into the abdomens of sexually mature males. These tests showed that the genes were silenced to the maximum, seven to eight days after the injection. Interferences in the behavior of sexually mature males with one or other silenced gene were evaluated by tests related to two parameters of reproductive behavior: changes in the general activities (any type of movement of insects) of males during the circadian cycle (day/night) and more specifically, activity related to reproductive behavior. Injection of dsRNAfru in adult males of A. sp.1 showed that they did not cause significant alterations in general activities, but it was observed that they cause a significant decrease in the number of males that performed reproductive activities, suggesting that silencing of fruitless. alters the normal functioning of male sexual behavior. In contrast, when injecting dsRNAper. in adult males of A. sp.1, no significant alteration was observed neither in their reproductive activities nor in their general activities. Moreover, silencing of the genes seems not to affect the production of spermatozoa. Although controversial, the data are in line with observations in D. melanogaster, in which the null mutant per04 did not present significant alterations in behaviors relatives to the control males in a Day/Night cyclic regime. Thus, additional analyzes will be needed to elucidate the participation of the two genes in the coordination of behaviors in Anastrepha sp.1 aff fraterculus