Gene Expression Profiles and Possible Interactions between microRNAs and mRNAs in Type 1 Diabetes Mellitus, Focusing on Response to Oxidative Stress and DNA Repair

O Diabetes Mellitus tipo 1 (DM1) resulta de um ataque autoimune contra as células pancreáticas, extinguindo a produção de insulina e levando à hiperglicemia. Evidências indicam uma associação entre o estresse oxidativo (que pode causar danos no DNA) e o DM1, sendo que apenas alguns trabalhos da literatura relataram a expressão de genes relacionados à respostas ao estresse oxidativo e reparo do DNA em DM1. Ainda, os microRNAs (reguladores pós-transcricionais da expressão gênica) estão envolvidos em vários processos biológicos e condições patológicas, mas informação sobre a expressão dos microRNAs em DM1 ainda é escassa. A fim de proporcionar um melhor entendimento sobre as vias de regulação de genes participantes de processos biológicos relevantes para o DM1, o presente estudo consistiu em analisar os perfis de expressão gênica (método de microarranjos) de microRNAs e de mRNAs (bem como de algumas proteínas) provenientes de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs, do inglês peripheral blood mononuclear cells) de pacientes DM1 (n=19) em comparação com indivíduos sadios não diabéticos (n=11), dando maior enfoque a genes associados à resposta ao estresse oxidativo e reparo do DNA. Os resultados de expressão obtidos pelo método de microarranjos apontaram 44 microRNAs diferencialmente expressos (35 induzidos e nove reprimidos) nos pacientes DM1 e esses microRNAs apresentaram grande especificidade ao estratificar pacientes DM1 dos controles, incluindo hsa-miR-101, hsa-miR148a, hsa-miR-27b e hsa-miR-424, cujos dados de expressão foram confirmados por qRT-PCR. A análise funcional dos genes-alvo dos microRNAs, tanto dos induzidos quanto dos reprimidos, apontou 22 e 12 vias KEGG significativamente enriquecidas, respectivamente, incluindo vias relacionadas ao câncer. Com relação à análise de expressão de mRNAS, 277 genes diferencialmente expressos foram identificados nos pacientes DM1, sendo que 52% deles são potenciais alvos dos microRNAs diferencialmente expressos nos pacientes DM1. Dentre esses alvos foram encontrados genes candidatos ao desenvolvimento da doença, assim como genes implicados nos processos biológicos resposta ao estresse oxidativo e reparo do DNA, como UCP3, PTGS2, ATF3, FOSB, DUSP1 e TNFAIP3, cujos dados de expressão foram confirmados por qRT-PCR. Já a análise de grupos gênicos identificou 49 e 55 grupos gênicos significativamente expressos e enriquecidos em pacientes DM1, respectivamente, destacando-se vias relacionadas à sinalização apoptótica, resposta ao hidroperóxido, reparo do DNA por recombinação homóloga e resposta ao estresse do retículo endoplasmático. Quanto aos dados de expressão proteica (western blotting), PTGS2 e ATF3 não apresentaram níveis de expressão detectáveis em nenhum dos dois grupos estudados, enquanto que para DUSP1 não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos, apesar de os três genes se apresentarem induzidos em pacientes DM1. Os resultados do ensaio do gene repórter da luciferase demonstraram a ocorrência da interação entre hsa-miR-148a e DUSP1 em meio celular. Essa evidência aliada aos dados de western blotting, sugerem a possibilidade de hsa-miR-148a atuar na repressão traducional de DUSP1. Em conjunto, os resultados do presente estudo indicaram perfis distintos de expressão de microRNAs e mRNAs em PBMCs de pacientes DM1 comparados a indivíduos sadios, sendo que adicionalmente, dados inéditos relacionados à interação microRNAs-mRNAs em DM1 foram obtidos, principalmente associados à resposta ao estresse oxidativo e reparo do DNA, sugerindo um distúrbio na rede microRNA-alvo em pacientes DM1.Type 1 Diabetes Mellitus (T1DM) results from an autoimmune attack against the pancreatic cells, ceasing insulin production, which causes hyperglycemia. Although associations between oxidative stress, which can cause DNA damage, and T1DM have been demonstrated, only a few studies have reported differential expression of genes associated with response to oxidative stress and DNA repair in T1DM patients. Moreover, microRNAs (post-transcriptional regulators of gene expression) are implicated in many biological processes and pathological conditions; however, only scarce information is available in the literature concerning the expression of microRNAs in T1DM. In order to better understand the regulatory pathways involved in biological processes that are relevant to T1DM, we aimed to investigate the microRNA and mRNA transcriptional expression profiles by microarray analysis (as well as expression of selected proteins) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from T1DM patients (n=19) compared with healthy non-diabetic individuals (n=11), emphasizing genes related to response to oxidative stress and DNA repair. Microarray expression results indicated 44 differentially expressed microRNAs (35 up- and nine down-regulated) in T1DM patients, with those microRNAs possessing a discriminatory power to clearly stratify the patients from the controls, including hsa-miR-101, hsa-miR148a, hsa-miR-27b, and hsa-miR-424, whose expression data were confirmed by qRT-PCR. Functional annotation analysis performed on the predicted targets of the differentially expressed microRNAs pointed 22 and 12 annotated KEGG pathways for the overexpressed and repressed microRNAs, respectively, many of them related to cancer. Regarding mRNA microarray results, we detected 277 differentially expressed genes in T1DM patients, with 52% of them being potential targets of the differentially expressed microRNAs in T1DM patients. Among these targets, we identified candidate genes for T1DM as well as genes involved in the biological processes response to oxidative stress and DNA repair, such as UCP3, PTGS2, ATF3, FOSB, DUSP1 and TNFAIP3, whose expression data were confirmed by qRT-PCR. Furthermore, out of the 49 and 55 significantly expressed/enriched gene sets in T1DM patients, respectively, five pathways related to apoptotic signaling, response to hydroperoxide, DNA repair via homologous recombination, and response to endoplasmic reticulum stress were of interest for the present work. Concerning protein expression results (western blotting), PTGS2 and ATF3 expression was not detected for either the patient or the control group, while significant difference in DUSP1 expression was not observed between the two groups, although the corresponding mRNAs of those genes were found induced. Regarding the luciferase assay, our results demonstrated that the interaction between hsa-miR-148a and DUSP1 occurs in the cellular milieu. Therefore, these findings together with those western blotting results suggest that hsa-miR-148a could play a role in DUSP1 translational repression. Altogether, our results indicate distinctive microRNA and mRNA expression profiles in PBMCs from T1DM patients relative to healthy non-diabetic individuals. Furthermore, we have provided novel data regarding microRNA-mRNA interactions in T1DM, in particular involving genes associated with response to oxidative stress and DNA repair, suggesting a perturbation in the microRNA-target network in T1DM patients