Efeito inibitório de nanopartículas de prata na atividade de bactérias oxidadoras de amônia

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2016.Os nanomateriais estão sendo amplamente utilizados em nosso cotidiano, com diferentes finalidades. A nanopartículas de prata (NPAg) é conhecida por suas propriedades antimicrobianas e é uma das mais comuns em produtos de consumo, tais como tecidos utilizados em roupas para prática de esportes, produtos médicos, produtos para bebês e muitos outros. O uso generalizado de NPAg pode aumentar sua liberação para ambientes naturais e às estações de tratamento de águas residuárias, onde podemos encontrar bactérias do ciclo do nitrogênio. Entre elas são bactérias oxidadoras de amônio (BOA), que são consideradas extremamente sensíveis às mudanças no ambiente. Como as NPAgs afetam a atividade dessas bactérias, importantes agentes reguladores do nitrogênio na natureza, este trabalho visa avaliar sua inibição em processo em batelada e em processo contínuo perante uma cultura pura de Nitrosomonas europaea e também uma cultura enriquecida em BOA, utilizando nanopartícula comercial. Para isso foram feitos testes inibição em batelada e em contínuo, de tempo de exposição, testes cinéticos, de microscopia e expressão gênica, expondo a bactéria à NPAg e Ag+. Os ensaios com cultura pura, nas concentrações de 0,075 mgAgNO3. L-1 (íon de prata), 0,075, 0,25, 0,50 e 0,75 mgAg_NPAg.L-1. Os resultados indicaram que as NPAg apresentam toxicidade elevada sobre a N. europaea, reduzido a velocidade de oxidação de amônia de 80,95 mgNO2-.L-1.d-1 para 46,43 mgNO2-.L-1.d-1 quando exposto à 0,75 mgAg_NPAg.L-1 (inibição foi de 42%). A concentração necessária para inibir a atividade em 50% (KI50) foi de 0,85 mgAg_NPAg.L-1. Íons de prata geraram 100% de inibição da cultura. A expressão gênica corroborou com esses resultados, indicando que existem outros caminhos metabólicos sendo utilizados pela bactéria na presença desse tóxico, podendo haver formação de N2O, gás do efeito estufa. A cultura mista também apresentou maior suscetibilidade ao Ag+ do que à NPAg, sendo que a concentração necessária para inibir 50% da atividade foi de 0,36 mgAgNO3.L-1 e 10,75 mgAg_NPAg.L-1, quase 30 vezes maior. Através de imagens produzidas MEV foi possível observar que a NPAg age sobre a membrana celular, causando ruptura da mesma em elevadas concentrações. Já o íon não apresentou danos relevantes à superfície da bactéria, agindo internamente. A comunidade nitritante perdeu atividade após a exposição contínua à 4,35 mgAg_NPAg.L-1, indicando que o acúmulo de amônia, devido a redução da atividade bacteriana com consequente esgotamento do sistema estudado. Por fim, um teste de tempo de exposição indicou que a toxicidade da NPAg é exclusivamente dependente da dose aplicada, sendo independente do tempo de exposição.Abstract: Nanomaterials are being widely used in our daily lives, with different purposes. Silver nanoparticle (NPAg) is known by its antimicrobial properties and is one of the most common in consumer products, such as sports cloths, medical products, baby products and many others. The widespread use of NPAg can increase its release to natural environments and to wastewater treatment plants (WWTP), where we can find bacteria from the Nitrogen cycle. Among them are ammonia oxidizing bacteria (AOB), that are considered extremely sensitive to environment changes. NPAg can affect the activity from this group of bacteria, and disrupt the nitrogen cycle. Therefore, this works objective was to evaluate the inhibition caused by NPAg during batch and continuous experiments towards a pure culture of Nitrosomonas europaea and also to a enriched culture AOB, using a commercial silver nanoparticles. Several tests were performed, such as: batch assays and continuous tests, dose and contact time batches, among other tests in order to try to understand the mechanism behind this inhibition. Pure culture batches were exposed to 0.075 AgNO3.L-1 (silver ion), 0.075, 0.25, 0.50 e 0.75 mgAg_NPAg.L-1. Nitrite production rate, fluorescence microscopy analysis and molecular biological methods were used to verify the toxic effect of those concentrations of silver. Results pointed out that NPAg cause inhibition of N. europaea, reducing ammonia oxidation rate from 80.95 mgNO2-L-1.d-1 ,in control, to 46.43 mgNO2-.L-1.d-1 when exposed to 0.75 mgAg_NPAg.L-1 (42% of inhibition). NPAg concentration needed to reduce bacterial activity in 50% (KI50) was 0.85 mgAg_NPAg.L-1. Silver ions caused 100% of inhibition. Gene expression corroborates with these results, indicating that there are other metabolic pathways being used by the bacteria in the presence of this toxic compound, with possible formation of N2O, a greenhouse gas. The mixed culture also showed higher susceptibility to silver ion than NPAg. Wherein the KI50 was 0.36 mgAgNO3.L-1 and 10.75 mgAg_NPAg.L-1, almost 30 times higher. SEM images showed how NPAg generates pints and breakage of cell membrane in when exposed to high concentrations of NPAg. However, Ag+ did not cause damage the surface of the bacteria, acting internally. The nitrifying community lost activity after continuous exposure to 4.35 mgAg_NPAg.L-1, ammonia accumulated, generating being toxic to the culture. Finally, a contact time test shown that the inhibition caused by NPAg is exclusively dependent of the dose and independent of the exposure time