Atividade antineoplásica in vitro e in vivo da chalcona n9 e seu possível mecanismo de ação

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011As chalconas (1,3-diaril-2-propen-1-onas), formam o núcleo de uma ampla variedade de compostos biológicos obtidos de vegetais, que têm espontado como potenciais agentes antitumorais. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo principal avaliar os efeitos antineoplásicos in vitro e in vivo do composto Chalcona N9, obtido sinteticamente. A Chalcona N9 demonstrou ser citotóxica nas linhagens celulares de carcinoma de pulmão humano A549, melanoma de camundongos B16-F10, glioma de rato C6, carcinoma de próstata humano DU 145, carcinoma de mama humano MCF-7 e glioblastoma humano U-87 MG e com citotoxicidade menor sobre a linhagem imortalizada de fibroblastos L929. Nos ensaios de citometria de fluxo para avaliação do ciclo celular foi demonstrado que a Chalcona N9 induziu o acúmulo de células U-87 MG na transição das fases G1-S. Ensaios por Western blotting demonstraram que a Chalcona N9 foi capaz de interferir na expressão de proteínas que participam do ciclo celular, reduzindo a expressão das ciclinas A, D1 e E, e quinases dependentes de ciclina CDK 2 e 6 nas células de glioma humano U-87 MG. Os ensaios de incorporação de Anexina V-FITC demonstraram que as duas concentrações utilizadas da Chalcona N9 induziram a morte por apoptose nas células U-87 MG ao final de 24 horas, e aumento no número de células apoptóticas ao final de 48 horas de tratamento com a Chalcona N9. A morte por apoptose foi também confirmada pelo ensaio de TUNEL. Através da utilização da sonda fluorescente JC-1, foi possível verificar que a Chalcona N9 alterou o potencial de membrana mitocondrial, num período de 2 até 24 horas, sugerindo um efeito sustentado sobre a permeabilidade mitocondrial. Alterações morfológicas da U-87 MG, como células arredondadas e fragmentação no núcleo, puderam ser visualizadas quando observadas por microscopia de fluorescência após o período de 24 horas de incubação com a Chalcona N9 na maior concentração utilizada. O tratamento com a Chalcona N9 reduziu significativamente o número de colônias das células U-87 MG, após 24 horas de incubação. O número de clones das células de glioblastoma multiforme após 48 horas de tratamento, foi significativamente reduzido, comparado com os clones das células do grupo controle. Nos modelos de tumor ascítico de Ehrlich em camundongos BALB/c, modelo de melanoma B16-F10 em camundongos C57Bl/6 e glioblastoma multiforme humano em camundongos nude, inoculados com as células U-87 MG, a Chalcona N9 foi capaz de reduzir a progressão tumoral. Em resumo, podemos concluir que a Chalcona N9 promove um atraso no ciclo celular, especialmente na fase de transição G1/S, além de promover o desencadeamento do processo apoptótico. O tratamento com a Chalcona N9 também altera o potencial de membrana mitocondrial e diminui o potencial proliferativo das células U-87 MG. Nossos resultados sugerem que a Chalcona N9 apresenta potencial atividade antitumoral sugerindo potenciais perspectivas com este composto em terapias contra o câncer.The chalcones (1,3-diaryl-2-propen-1-ones), a group of aromatic enones, form the core of a wide variety of organic compounds obtained from plants, and in the past 15 years those compounds have emerged as potential antitumor agents. This study aimed at evaluating the in vitro and in vivo antineoplastic effects of the compound Chalcone N9, which was synthetically obtained. The Chalcone N9 was shown to be cytotoxic in cell lines of human lung carcinoma A549, mouse melanoma B16-F10, rat glioma C6, human prostate carcinoma DU 145, human breast carcinoma MCF-7 and human glioblastoma U-87 MG and with lower cytotoxicity in immortalized fibroblast line L929. In tests of flow cytometry used to assess the cell cycle of U-87 MG cells, it was demonstrated that Chalcone N9 induced accumulation of cells in transition from G1-S phase. Western blotting assays showed that Chalcone N9 was able to influence the expression of proteins involved in the cell cycle, reducing the expression of cyclins A, D1 and E and the cyclin dependent kinases CDK 2 and 6. The annexin V-Fitc assay, which detects the incorporation of annexin, demonstrated that both concentrations of Chalcone N9 induced apoptosis in U-87 MG cell after 24 hours and increased the number of apoptotic cells after 48 hours of incubation with Chalcone N9. Death by apoptosis was also confirmed by TUNEL assay. By using the fluorescent probe JC-1, we observed that halcone N9 altered the mitochondrial membrane potential in a period of 2 to 24 hours, suggesting a sustained effect on mitochondrial permeability. Morphological changes of U-87 MG as round cells and fragmentation in the nucleus could be visualized when observed by fluorescence microscopy after 24 hours incubation with Chalcone N9 at the highest concentration used. Treatment with Chalcone N9 significantly reduced the number of colonies of cells U-87 MG, 24 hours after incubation. The number of clones of cells of glioblastoma multiforme after 48 hours of treatment was significantly reduced compared with clones of cells of the control group. In the models of Ehrlich ascites tumor in BALB/c mice, melanoma B16-F10 in C57BL/6 mice and human glioblastoma multiforme in nude mice inoculated with U-87 MG cells, Chalcone N9 was able to reduce tumor progression. In summary, we conclude that the Chalcone N9 promotes a delay in cell cycle, especially during the transition G1 / S, besides promoting the activation of the apoptotic process. Treatment with Chalcone N9 also changes the mitochondrial membrane potential and decreases the proliferative potential of U-87 MG cells. Our results suggest that Chalcone N9 has a potential antitumor activity suggesting potential prospects with this compound in cancer therapies