Caracterização farmacológica in vitro e in vivo de substâncias naturais como ativadoras do receptor TRPA1 em roedores

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pos-Graduação em Farmacologia.O presente estudo avaliou através do emprego de abordagens farmacológicas in vitro e in vivo, alguns dos mecanismos envolvidos na ativação do receptor TRPA1 (receptor de potencial transitório com domínios anquirina 1), um membro da família de canais catiônicos TRP (receptor de potencial transitório). De forma semelhante ao agonista do receptor TRPV1 (receptor de potencial transitório vanilóide 1), a capsaicina, os agonistas do receptor TRPA1, o isotiocianato de alila e o cinamaldeído, causaram contração da bexiga isolada de rato dependente de cálcio externo. Esta resposta foi susceptível a dessensibilização. O vermelho de rutênio, um antagonista não-seletivo dos receptores TRP, reduziu de forma significativa a resposta contrátil induzida pela capsaicina, pelo isotiocianato de alila ou pelo cinamaldeído. O antagonista seletivo do receptor TRPV1, o SB 366791, foi capaz de inibir completamente a resposta contrátil induzida pela capsaicina, enquanto reduziu parcialmente o efeito produzido pelos agonistas do receptor TRPA1. Ademais, a contração induzida pelo isotiocianato de alila foi significativamente reduzida pelos antagonistas dos receptores taquicinérgicos NK1, NK2 e NK3, tetrodotoxina e indometacina, mas não pela atropina ou suramina. Por outro lado, a contração causada pelo cinamaldeído foi inibida pelos antagonistas de receptores NK1 e NK2, tetrodotoxina ou indometacina. Em contraste à capsaicina, o isotiocianato de alila e o cinamaldeído não interferiram com a união específica do agonista [3H]-resiniferatoxina em membranas de medula espinhal de rato. A exposição da bexiga isolada de rato ao isotiocianato de alila causou aumento dos níveis de prostaglandina E2 e de substância P na solução nutritiva. A resposta contrátil induzida pela capsaicina ou pelo cinamaldeído na bexiga isolada de rato foi significativamente aumentada em ratos com cistite, em relação aos animais controle. Os resultados in vivo mostraram que, da mesma forma que a capsaicina, a injeção intraplantar de isotiocianato de alila ou cinamaldeído causou nocicepção espontânea dependente da dose em camundongos. A nocicepção induzida pela capsaicina ou pelo isotiocianato de alila foi reduzida pelo vermelho de rutênio ou pela capsazepina, antagonistas não seletivos do receptor TRPV1, mas não pelo antagonista seletivo de receptores NK1, o FK 888. O antagonista seletivo do receptor TRPV1, o SB 366791, inibiu somente a resposta nociceptiva provocada pela capsaicina, mas não aquela provocada pelo isotiocinato de alila. O tratamento neonatal de camundongos com capsaicina atenuou a nocicepção induzida pelo isotiocianato de alila ou pelo cinamaldeído. A degranulação prévia de mastócitos pelo composto 48/80 ou o tratamento com o antagonista de receptores histaminérgico H1 para a histamina, pirilamina, também inibiram de maneira significativa a resposta nociceptiva causada pela capsaicina ou pelo isotiocianato de alila. Em conjunto, estes resultados mostram que o isotiocianato de alila e o cinamaldeído induzem contração da bexiga isolada de ratos e nocicepção espontânea em camundongos. A resposta contrátil da bexiga é dependente de cálcio extracelular e da liberação de taquicininas e prostaglandina E2. Por outro lado, a nocicepção espontânea parece depender da ativação de fibras sensíveis à capsaicina e da liberação de histamina de mastócitos. The present study evaluated by use in vitro e in vivo pharmacological approaches some mechanisms involved in the activation of TRPA1 receptor (transient receptor potential ankyrin-like 1), a member of the TRP (transient potential receptor) ion channel family. Similar to the TRPV1 receptor agonist (transient receptor potential vanilloid 1) capsaicin, the agonists for TRPA1 receptor, allyl isothiocyanate and cinnamaldehyde, caused a external calcium-dependent contraction of rat isolated urinary bladder. This response was susceptible to desensitization. Ruthenium red, a non-selective TRP receptor antagonist, significantly reduced the contractile response induced by capsaicin, allyl isothiocyanate or cinnamaldehyde. The selective TRPV1 receptor antagonist SB 366791 was able to completely inhibit capsaicin-induced contractile response, whereas it partially reduced the effect produced by TRPA1 receptor agonists. In addiction, the contraction induced by allyl isothiocyante was significantly reduced by NK1, NK2 and NK3 tachykinin receptor antagonists, tetrodotoxin, and indomethacin, but not by atropine or suramin. On the other hand, the contraction caused by cinnamaldehyde was inhibited by NK1, NK2 receptors antagonists, tetrodotoxin or indomethacin. In contrast to capsaicin, allyl isothiocyanate and cinnamaldehyde did not interfere with [3H]-resiniferatoxin specific binding sites in membranes of rat spinal cord. The rat isolated urinary bladder exposition to allyl isothiocyanate caused an increase of prostaglandin E2 and substance P levels in nutritive solution. The contractile response induced by capsaicin or by cinnamaldehyde in rat isolated urinary bladder was significantly enhanced in rats with cystitis in relation to control animals. Our in vivo results showed that, similarly to capsaicin, intraplantar injection of allyl isothiocyanate or cinnamaldeyde caused spontaneous and dose-dependent nociception. Capsaicin or allyl isothiocyanate-induced nociception was reduced by ruthenium red or capsazepine, but not by NK1 receptor antagonist FK 888. The selective TRPV1 receptor antagonist SB 366791 inhibited capsaicin-evoked nociceptive response, but not that triggered by allyl isothiocyanate. Neonatal treatment of mice with capsaicin attenuated either allyl isothiocyanate- or cinnamaldehyde-induced nociception. Previous mast cells degranulation by compound 48/80 or the treatment with the H1 histaminergic receptor antagonist pyrilamine also significantly inhibited the nociceptive response caused by capsaicin or by allyl isothiocyanate. Taken together, these results shows that allyl isothiocyanate and cinnamaldehyde induced contraction of rat isolated urinary bladder and spontaneous nociception in mice. The bladder contractile response is dependent on extracellular calcium, tachykinin and prostaglandin E2 release. On the other hand, the spontaneous nociception appears to be dependent on capsaicin-sensitive fibers activation and histamine release from mast cells