Transfecção integrativa do gene da B-galactosidase em três espécies de leishmania e padronização de ensaio colorimétrico para triagem de compostos leishmanicida utilizando leishmania (V.) braziliensis

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015As leishmanioses afetam cerca de 12 milhões de pessoas e constituem um problema de saúde mundial. Faz-se necessário o desenvolvimento de metodologias para o estudo de novas entidades químicas ativas contra a doença e que sejam menos laboriosas, mais rápidas, sensíveis e compatíveis com a automação. No presente trabalho, realizou-se a transfecção de forma integrativa do gene da ß-galactosidase em três espécies de Leishmania (L. (L.) infantum, L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis) com o objetivo de padronizar um ensaio colorimétrico rápido e sensível para triagem de compostos contra amastigotas intracelulares de L. (V.) braziliensis. A transfecção dos parasitos não alterou suas características biológicas avaliadas pelo crescimento de promastigotas em cultura, a infectividade para células THP-1 e para camundongos Balb/c em nenhuma das cepas transfectadas. A atividade da enzima medida através de ensaio colorimétrico mostrou correlação direta entre a leitura e o número de parasitos. A expressão da enzima foi estável nas linhagens selecionadas, mesmo na ausência da pressão do antibiótico de seleção, indicando a integração do gene que foi confirmado através de PCR. Ensaios de atividade enzimática utilizando promastigotas mostraram um limite inferior de detecção de 780 parasitos por cavidade, permitindo a determinação da atividade enzimática em amastigotas intracelulares. A transfecção em L. (V.) braziliensis não alterou a susceptibilidade aos fármacos leishmanicicas de uso clínico: anfotericina B e miltefosina. Contudo, o processo de transfecção provocou a resistência dos parasitos aos fármacos paromomicina e glucantime, 3 a 10 vezes acima da IC50 da cepa parental. Os resultados obtidos pela metodologia colorimétrica foram semelhantes aos obtidos pela metodologia clássica de contagem através de microscopia, pasronizando assim o ensaio.Abstract : Leishmaniasis affects about 12 million people worldwide and represents a global health problem. It is necessary the development of less laborious, faster and more sensitive and compatible with automation methods for the study of new active compounds against the disease. In this present study, we transfeceted in a integrative form the ß-galactosidase in three species of Leishmania (L. (L.) infantum, L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis) aiming the standardization of a reproducible, fast and sensitive colorimetric assay for screening of compounds active against intracellular amastigotes using the transfected strain of L. (V.) braziliensis. Transfection did not alter the parasite?s biological characteristics evaluated by promastigote growth in culture, infectivity on THP-1 cells and on Balb/c mice for any of the transfected strain. The enzymatic activity measured by colorimetric assay showed direct correlation between the reading and the number of parasites. Enzymatic expression was stable under the selected strains even in the absence of the selection antibiotic pressure, indicating the integration of the gene, which was confirmed by PCR. Enzymatic activity assay using promastigotes showed a lower limit of 780 parasites per well, allowing the determination of the enzymatic activity in intracelular amastigotes. Transfection in L. (V.) braziliensis did not alter the susceptibility to the drugs: amphotericin B and miltefosine. However the trasnfection process led to resistance to the drugs paromomycin and glucantime, 3 to 10 times higher from the IC50 of the wild type parasite. Results obteinedby the colorimetric assay were similar to the ones obteined by the classical methodology of microscopic counting, validating the assay