Estudo do mecanismo de ação antiproliferativa e antitumoral de extratos de Casearia sylvestris e de fenilaminonaftoquinonas associadas ou não ao ascorbato de sódio

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014.Casearia sylvestris é uma planta utilizada popularmente no tratamento de tumores. Quinonas tratam-se de compostos que apresentam significativo efeito antitumoral. Evidências indicam que o efeito antineoplásico de quinonas pode ser elevado pela associação destas com o ascorbato de sódio (ASC). Desta forma, este trabalho tem como objetivo avaliar os mecanismos envolvidos nos efeitos antiproliferativo e antitumoral mediados pelo extrato bruto (EB-ETOH) e frações de Casearia sylvestris, bem como pelas fenilaminonaftoquinonas 7 (Q7) e 9 (Q9) administradas isoladamente ou em associação ao ascorbato de sódio. A análise fitoquímica demonstrou a presença de casearina C na fração clorofórmica (f-CHCl3) e EB-ETOH de C. sylvestris. EB-ETOH e f-CHCl3, apresentaram importante citotoxicidade sobre células MCF-7. Quando administrados em doses subtóxicas (= CI20), EB-ETOH e f-CHCl3 exerceram atividade antiproliferativa sobre células MCF-7, sendo capazes de promover a parada do ciclo celular em G1, devido ao aumento da expressão de p53 e p16, bem como da redução da expressão de CDK2. Além disso, os extratos elevaram a fosforilação de ?H2Ax. EB-ETOH e f-CHCl3 apresentaram significativa atividade antitumoral in vivo em camundongos isogênicos Balb-C portadores do tumor sólido de Ehrlich, reduzindo a razão área da massa tumoral/área do osso em torno de 18 e 40%, respectivamente. Q7 e Q9 mostraram citotoxicidade seletiva sobre células T24, a qual foi potencializada pela associação destes compostos a ASC (CI50 Q7 = 27,1; CI50 Q9 = 44,3; CI50 Q7 + ASC = 14,5; CI50 Q9 + ASC= 16,9 µM). Fenilaminonaftoquinonas (10 µM) isoladas ou associadas à ASC não foram capazes de promover a ativação de caspases e a clivagem da PARP, sugerindo-se que o mecanismo de morte induzido pelas associações trata-se de necrose, visto que ambos tratamentos promoveram lise celular. Q7, Q9, Q7 + ASC e Q9 + ASC reduziram a proliferação de células T24 em torno de 29,7; 3,5; 36,7 e 88,8 %, respectivamente Além disso, fenilaminonaftoquinonas associadas ao ASC modificaram o número de células presentes na fase G2/M e elevaram a atividade da ß-galactosidase ácida, sugerindo que tais tratamentos são capazes de induzir senescência. Os efeitos citotóxico e antiproliferativo promovidos pela associação de fenilaminonaftoquinonas ao ASC envolve modificações na sinalização mediada por MAPKs. Os resultados obtidos permitem sugerir que tanto a associação de fenilaminonaftoquinonas ao ASC, quanto os extratos deC. sylvestris tratam-se de promissores coadjuvantes na terapêutica do câncer quando administrados juntamente a agentes citotóxicos.Abstract : The branches and leafs of Casearia sylvestris tree has medicinal properties comproved through ethnobotanical surveys reporting plant extracts has being used in traditional therapy as first approaches to several conditions, including cancer. Evidences indicate that quinones antineoplastic effect could be raised up through sodium ascorbate association (ASC). Thus, this study aims to evaluate some mechanisms related to in vitro antiproliferative and antitumor effects mediated by C. sylvestris ethanol crude extract (EB-EtOH) and fractions, as well mediated only by synthetic phenylaminonaphthoquinones or co-administered with ASC. EB-EtOH and its chloroformic fraction (f-CHCl3) had casearin C, a clerodane diterpene with chemopreventive activity. Consequently, both extracts showed significant cytotoxicity over MCF-7 cells. Furthermore, using subtoxic concentrations (= IC20), EB - EtOH and f-CHCl3 exerted antiproliferative activity on MCF - 7 cells, being able to promote cell cycle arrest in G1 due to increased expression of p53 and p16, as well as reducing CDK2 expression. Additionally, these extracts were still able to increase the ?H2Ax expression. EB-EtOH and f-CHCl3 had significant in vivo antitumor activity throught Ehrlich carcinoma-bearing Balb-c mice model causing reduction in the ratio tumor over bone area about 18 and 40 %, respectively. On the other hand, synthetic phenylaminonaphthoquinone 7 (Q7) and phenylaminonaphthoquinone 9 (Q9) showed selective cytotoxicity for T24 cells, which enhanced in the ASC presence (IC50 Q7 = 27.1; IC50 Q9 = 44.3; IC50 Q7 + ASC = 14.5; IC50 Q9 + ASC = 16.9 µM). Take into account that both phenylaminonaphthoquinones (10 µM) isolated or associated with ASC were not able to activate caspase 3 or PARP cleavage, ours results suggest that necrosis occurs instead apoptosis as cell death mechanism possible induced by the ASC association, since both treatments showed cytolytic effect. Q7, Q9, Q7 + ASC and Q9 + ASC reducing cell proliferation about 29.7; 3.5; 36.7 and 88.8%, respectively. Besides, phenylaminonaphthoquinones associated with ASC augment G2 / M phase cells and also increase acid ß-galactosidase activity, suggesting senescence induction capability. Moreover, cytotoxic and antiproliferative effects promoted by the ASC association involves changes in MAPK signaling pathways. These results suggest that C. sylvestris extracts and the association between phenylaminonaphthoquinones and ASC are promising adjuvants incancer therapy and could be administered together with conventional quimioterapic agents